1

Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH với tiêu bản Parafin - Bộ y tế 2017

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

  • Kỹ thuật FISH được tiến hành d a trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử DN tồn tại dưới dạng ph n tử k p g m 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, ph n tử DN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại gh p nhau theo nguyên tắc bổ sung.
  • Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn DN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai gh p với các đoạn DN tương đ ng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.

II. CHỈ ĐỊNH

Chỉ định cho các bệnh lý ác tính và th c hiện với các mô sinh thiết đúc paraffin.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Nhân viên xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử đã được đào tạo.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

  • Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly t m, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
  • Dụng cụ : kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.

2.2. Hóa chất

- Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện.

- DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol.2HCl)/ antifade.

- Dung dịch xử lý tiêu bản.

- Protease buffer.

- Dung dịch PBS (phosphate buffered saline).

- Xi măng cao su (rubber cement): FixogumTM.

- Dung dịch ph n giải protein:

  •  Dung dịch 2 X SSC.
  •  Dung dịch rửa 2 X SSC, 0,05% Tween20, pH 7.0.
  •  Cồn 100o.
  •  Xylene
  •  Dung dịch 0,4 X SSC.

2.3. Người bệnh

Các đối tượng người bệnh có chỉ định của l m sàng.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Chuẩn bị tiêu bản

- Cho tiêu bản paraffin vào tủ ấm 60oC tối thiểu 2 tiếng trước khi loại b paraffin.

- Loại bỏ paraffin:

  •  Làm nóng tiêu bản paraffin lên 60oC.
  •  Chuyển tiêu bản paraffin ở 60oC vào cóng chứa xylene trong 10 phút.
  •  Chuyển tiêu bản paraffin qua hai cóng chứa c n 100oC, mỗi cóng trong 5 phút. Để khô tiêu bản parafin t nhiên.
  •  Chuyển tiêu bản paraffin vào cóng chứa dung dịch xử lý tiêu bản từ 10 đến 15 phút. (pH = 6.0, 96-98oC).
  •  Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
  •  Chuyển tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch enzym ph n giải protein (40ml protease buffer + 100μl protease).
  •  Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
  •  Chuyển tiêu bản paraffin qua cóng chứa c n 100oC trong 2 phút.
  •  Để khô t nhiên.

2. Lai huỳnh quang tại chỗ

2.1. Chuẩn bị probe

  •  Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2 μl dH2O) /1tiêu bản
  •  Ly tâm nhẹ.

2.2. Lai

  •  Nhỏ 10 μl dung dịch probe vào khu v c đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.  Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
  •  Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
  •  Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương tr nh biến tính ở 73oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.

2.3. Rửa sau khi lai

- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip.

- Ng m và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau:

  •  Dung dịch 0,4X SSC, pH 7.0: 2 phút, 73oC.
  •  Dung dịch 2X SSC, Tween20 (pH7.0): 30 gi y, nhiệt độ ph ng.

- Rửa nhanh bằng nước cất.

- Làm khô tiêu bản.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

  •  Nh 10-20 μl dung dịch antifade lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và ổn định tín hiệu D PI trên tương bào.
  •  Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.
  •  Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc thích hợp.
  •  Quy tắc ph n tích theo hướng dẫn c thể của nhà sản xuất cho từng loại probe.
  • Thông thường sẽ tiến hành ph n tích 100 tương bào để đưa ra kết quả cuối cùng.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

 

Vấn đề  Nguyên nhân Cách khắc phục
Không có tín hiệu hoặc tín hiệu yếu Kính hiển vi không thích hợp hoặc có sự cố  Kiểm tra lại kính và các vật kính
Probe không biến tính hoàn toàn  Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng (73+/-1)oC
Điều kiện lai không thích hợp

Kiểm tra nhiệt độ tủ ấm có đúng 37oC hay không.

Tăng thời gian lai lên 1giờ.

Điều kiện rửa không thích hợp

Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng 73oC

Kiểm tra các thành phần dung dịch rửa (pH...)

Xuất hiện bọt khí giữa tiêu bản và coverslip Loại bỏ bọt khí
Bảo quản probe không đúng cách Bảo quản probe ở -20oC, không ánh sang
Tín hiệu đặc trưng yếu Điều kiện lai không thích hợp Kiểm tra nhiệt đổ tủ ấm có đúng 37oC
Nhiệt độ dung dịch rửa quá thấp Duy trì nhiệt độ dung dịch rửa ở (73+/-1)oC
Nền quá bẩn Tiêu bản làm già quá mức cho phép hoặc chứa nhiều tế bào chất Tăng thời gian biến tính của tiêu bản lên 10 phút
Tiêu bản không sạch hoặc nhiều mảnh vỡ tế bào trên tiêu bản  Chuẩn bị lại tiêu bản
Các mảnh DN không sạch Thực hiện lại bước rửa tiêu bản sau khi lai với formamide
Dung dịch rửa sai thành phần và nhiệt độ Kiểm tra lại dung dịch rửa
Hình thái các tế bào bị co cụm, biến dạng Để tiêu bản bị quá khô Tăng độ ẩm hoặc tăng nhiệt độ bể ấm trong quá tr nh tiến hành thí nghiệm
Tiêu bản chưa được sấy khô trước khi biến tính

Chuẩn bị lại xét nghiệm với tiêu bản mới

Làm già tiêu bản trước khi tiến hành FISH 24 giờ

Tiêu bản chưa khô sau biến tính 

Sấy tiêu bản ở nhiệt độ 45oC trong 10-15 phút sau biến tính
Nhiệt độ bể ấm quá cao Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng (73+/-1)oC
Thời gian biến tính quá lâu Giảm thời gian biến tính 1 phút
Tín hiệu quá mạnh Nồng độ probe sử dụng quá cao so với dải màu của KHV Cố gắng chỉnh kính thay thế bằng các dải màu trung lập

 

Bài viết nghiên cứu có thể bạn quan tâm
Xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp và gián tiếp bằng kỹ thuật flow cytometry - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Quy trình xác nghiệm gen bằng kỹ thuật cIg FISH - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Xét nghiệm virus ZIka bằng kỹ thuật PCR - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Phẫu thuật đặt võng nâng cổ bàng quang (Sling) trong tiểu không kiểm soát  khi gắng sức - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật ngoại khoa chuyên khoa phẫu thuật tiết niệu - Bộ y tế 2017

Tin liên quan
Điều trị són tiểu bằng thủ thuật treo cổ bàng quang
Điều trị són tiểu bằng thủ thuật treo cổ bàng quang

Treo cổ bàng quang là một giải pháp cho những trường hợp bị tiểu không tự chủ khi tăng áp lực nghiêm trọng, các triệu chứng gây cản trở cuộc sống hàng ngày và các phương pháp điều trị khác không hiệu quả.

Phẫu thuật chuyển lưu dòng tiểu trong điều trị ung thư bàng quang
Phẫu thuật chuyển lưu dòng tiểu trong điều trị ung thư bàng quang

Phẫu thuật chuyển lưu dòng tiểu tạo ra một con đường mới để đưa nước tiểu ra khỏi cơ thể sau khi cắt bỏ bàng quang. Có ba loại phẫu thuật chuyển lưu dòng tiểu, hai trong số đó giúp người bệnh kiểm soát thời điểm đi tiểu.

Nuôi con bằng sữa mẹ và tiểu đường thai kỳ
Nuôi con bằng sữa mẹ và tiểu đường thai kỳ

Sữa mẹ là thức ăn lý tưởng cho trẻ sơ sinh vì nó chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và kháng thể mà em bé cần. Và khi bạn bị tiểu đường thai kỳ, có những lợi ích bổ sung liên quan đến việc cho con bú.

Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu là gì?
Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu là gì?

Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu là một phương pháp xét nghiệm giúp phát hiện các vấn đề được biểu hiện qua dấu hiệu bất thường trong nước tiểu.

Bao lâu sau nhiễm HSV thì xuất hiện triệu chứng và phát hiện được bằng xét nghiệm?
Bao lâu sau nhiễm HSV thì xuất hiện triệu chứng và phát hiện được bằng xét nghiệm?

Sau khi phơi nhiễm với virus herpes thì có thể phải sau từ 2 đến 12 ngày thì các triệu chứng mới xuất hiện và phát hiện được bằng các phương pháp xét nghiệm.

Hỏi đáp có thể bạn quan tâm
Làm xét nghiệm tiểu đường thai kì có cần nhịn ăn?
  •  3 năm trước
  •  1 trả lời
  •  1597 lượt xem

Vào tuần thứ 29, em đi khám thai thì bác sĩ bảo em bị tiểu đường thai kỳ. Bác sĩ hẹn 2 tuần sau tái khám sẽ làm xét nghiệm máu để xem định lượng HbA1c và định lượng Glucose sau ăn 2 giờ là thế nào? Vậy, trước khi làm hai xét nghiệm này em có cần nhịn đói không hay vẫn ăn bình thường

Có cần xét nghiệm nước tiểu chồng khi vợ mang thai không?
  •  2 năm trước
  •  1 trả lời
  •  612 lượt xem

Em mang thai 12 tuần. đi khám ở Bệnh viện, bs ghi là bị thiếu sắt và có cho giấy để chồng đi xét nghiệm nước tiểu. Bác sĩ cho em hỏi là tại sao phải kiểm tra nước tiểu của chồng ạ?

Kết quả xét nghiệm máu và nước tiểu, có sao không?
  •  2 năm trước
  •  1 trả lời
  •  764 lượt xem

Em vừa đi siêu âm kiểm tra độ mờ da gáy và xét nghiệm máu, nước tiểu. Bs đọc kết quả bảo là bình thường. Nhưng có một vài chỉ số vượt quá ngưỡng như: Xét nghiệm huyết học: * WBC: 11.9 (CSBT: 4-10) * Neu: 76.3 (CSBT: 40-74) * Lym: 16.6 (CSBT: 25-75) 03 * RhD (gelcard): + * Coombs gián tiếp: Âm tính * Coombs trực tiếp: Âm tính - Xét nghiệm nước tiểu * Urobilinogen: Âm tính (CSBT: 1.5-30) * Bạch cầu: ++125 (CSBT: Âm tính) - Mong được bs tư vấn ạ?

Cơ hội thụ thai được bao nhiêu sau thủ thuật đảo ngược triệt sản?
  •  4 năm trước
  •  1 trả lời
  •  833 lượt xem

- Thưa bác sĩ, cơ hội thụ thai sẽ được bao nhiêu sau thủ thuật đảo ngược triệt sản ạ? Bác sĩ giải đáp giúp tôi với nhé!

Có đúng thai phụ thường bị mất cân bằng không?
  •  4 năm trước
  •  1 trả lời
  •  782 lượt xem

- Bác sĩ ơi, từ khi mang thai, nhiều lúc tôi có cảm giác người mình cứ chông chênh, đứng không vững. Bác sĩ có thể lý giải tình trạng mất cân bằng ở thai phụ giúp tôi không ạ? Cảm ơn bác sĩ!

Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây