Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH với tiêu bản Parafin - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

• Kỹ thuật FISH được tiến hành d a trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử DN tồn tại dưới dạng ph n tử k p g m 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, ph n tử DN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại gh p nhau theo nguyên tắc bổ sung.
• Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn DN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai gh p với các đoạn DN tương đ ng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.

II. CHỈ ĐỊNH

Chỉ định cho các bệnh lý ác tính và th c hiện với các mô sinh thiết đúc paraffin.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Nhân viên xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử đã được đào tạo.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

• Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly t m, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
• Dụng cụ : kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.

2.2. Hóa chất

- Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện.

- DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol.2HCl)/ antifade.

- Dung dịch xử lý tiêu bản.

- Protease buffer.

- Dung dịch PBS (phosphate buffered saline).

- Xi măng cao su (rubber cement): FixogumTM.

- Dung dịch ph n giải protein:

•  Dung dịch 2 X SSC.
•  Dung dịch rửa 2 X SSC, 0,05% Tween20, pH 7.0.
•  Cồn 100o.
•  Xylene
•  Dung dịch 0,4 X SSC.

2.3. Người bệnh

Các đối tượng người bệnh có chỉ định của l m sàng.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Chuẩn bị tiêu bản

- Cho tiêu bản paraffin vào tủ ấm 60oC tối thiểu 2 tiếng trước khi loại b paraffin.

- Loại bỏ paraffin:

•  Làm nóng tiêu bản paraffin lên 60oC.
•  Chuyển tiêu bản paraffin ở 60oC vào cóng chứa xylene trong 10 phút.
•  Chuyển tiêu bản paraffin qua hai cóng chứa c n 100oC, mỗi cóng trong 5 phút. Để khô tiêu bản parafin t nhiên.
•  Chuyển tiêu bản paraffin vào cóng chứa dung dịch xử lý tiêu bản từ 10 đến 15 phút. (pH = 6.0, 96-98oC).
•  Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
•  Chuyển tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch enzym ph n giải protein (40ml protease buffer + 100μl protease).
•  Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
•  Chuyển tiêu bản paraffin qua cóng chứa c n 100oC trong 2 phút.
•  Để khô t nhiên.

2. Lai huỳnh quang tại chỗ

2.1. Chuẩn bị probe

•  Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2 μl dH2O) /1tiêu bản
•  Ly tâm nhẹ.

2.2. Lai

•  Nhỏ 10 μl dung dịch probe vào khu v c đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.  Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
•  Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
•  Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương tr nh biến tính ở 73oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.

2.3. Rửa sau khi lai

- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip.

- Ng m và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau:

•  Dung dịch 0,4X SSC, pH 7.0: 2 phút, 73oC.
•  Dung dịch 2X SSC, Tween20 (pH7.0): 30 gi y, nhiệt độ ph ng.

- Rửa nhanh bằng nước cất.

- Làm khô tiêu bản.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

•  Nh 10-20 μl dung dịch antifade lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và ổn định tín hiệu D PI trên tương bào.
•  Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.
•  Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc thích hợp.
•  Quy tắc ph n tích theo hướng dẫn c thể của nhà sản xuất cho từng loại probe.
• Thông thường sẽ tiến hành ph n tích 100 tương bào để đưa ra kết quả cuối cùng.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ