1

Xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp và gián tiếp bằng kỹ thuật flow cytometry - Bộ y tế 2017

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

  •  Trên bề mặt tiểu cầu có các kháng nguyên tiểu cầu HP , kháng nguyên bạch cầu HL và kháng nguyên nhóm máu BO. Trong những điều kiện nhất định, có thể có thể sinh các t kháng thể chống lại các kháng nguyên tiểu cầu của chính m nh (bệnh giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc sinh kháng thể đ ng loại chống các kháng nguyên tiểu cầu truyền vào. Các kháng thể kháng tiểu cầu có thể t n tại t do trong huyết tương hoặc đã gắn trên bề mặt tiểu cầu.Hầu hết các kháng thể này là kháng thể miễn dịch có bản chất là IgG.
  •  Dùng kháng thể đơn d ng gắn huỳnh quang kháng IgG người có thể phát hiện được kháng thế kháng tiểu cầu tr c tiếp (kháng thể đã gắn lên tiểu cầu) hoặc kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp (kháng thể t do trong huyết tương).

II. CHỈ ĐỊNH

  • Người bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu nghi do miễn dịch;
  • Người bệnh truyền máu, tiểu cầu nhiều lần;
  • Người bệnh truyền tiểu cầu không hiệu l c.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

  •  Kỹ thuật viên, cử nh n đã được đào tạo th c hiện k thu t;
  •  Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện hóa chất

2.1. Phương tiện

  • Máy ph n tích tế bào d ng chảy (máy flow cytometry);
  • Máy ly tâm;
  • Máy lắc trộn (máy votex);
  • Pipet và đầu pipet các loại 250 và 1.000 microlit;
  • Các ống nghiệm chuyên d ng cho flow cytometry;
  • Găng tay làm x t nghiệm.

2.2. Hóa chất

  •  Anti CD61-PE;
  •  Anti human IgG-FITC;
  •  Anti human IgM-FITC;
  •  Dung dịch PBS-EDTA;
  •  Dung dịch sheath chạy máy flow;
  •  Nước cất, hóa chất khử trùng Natri hypoclorite;
  •  Mẫu chứng âm: lag mẫu huyết thanh người không có kháng thể kháng tiểu cầu;
  •  Mẫu chứng dương: là mẫu huyết thanh người có kháng thể kháng tiểu cầu;
  •  5 mẫu tiểu cầu của người cho máu cùng nhóm BO với người bệnh.

3. Bệnh phẩm

Cần 2 mẫu máu (1 mẫu chống đông natri citrate, 1 mẫu đông) lấy từ người bệnh có chỉ định làm x t nghiệm.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

  •  Người bệnh: 2 ml máu chống đông bằng natri citrate; 2 ml máu đông;
  •  5 mẫu tiểu cầu người cho cùng nhóm BO của người bệnh (lấy từ các d y tiểu cầu của túi tiểu cầu trong ng n hàng máu;
  •  Mẫu chưa làm ngay có thể giữ trong tủ lạnh 2-8oC trong v ng 3 ngày.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp

- Chuẩn bị bệnh phẩm

  •  Ly tâm ống máu người bệnh chống đông bằng natri citrate để tách huyết tương giầu tiểu cầu: ly t m 500 v ng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ thường.
  •  Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDT : ly t m 3000 v ng/phút trong 5 phút.
  •  Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDT n ng độ 1 x107/ml.

- Ủ kháng thể

  •  Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn dòng theo sơ đồ sau. Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ ph ng, tránh ánh sang. Sơ đồ ủ mẫu như sau:

 

Ống số

Tiểu cầu

BN

Anti

CD61-PE

Anti mouse

IgG-PE

Anti mouse

IgG-FITC

Anti human

IgG-FITC

1 100 μl - 20 μl 20 μl  
2 100 μl 20 μl   20 μl  
3 100 μl 20 μl   - 20 μl

 

  •  Sau ủ kháng thể, rửa b kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA, ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút. Đổ bỏ dịch nỗi giữ lại cặn tế bào.
  •  Sau rửa, tái huyền dịch tiểu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDT và trộn đều.
  • Lúc này ống đã sẵn sang cho ph n tích.

2.2. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp

- Chuẩn bị bệnh phẩm

+ Chuẩn bị tiểu cầu giá thể:

  •  Trộn 5 mẫu tiểu cầu cùng nhóm BO người bệnh với tỷ lệ tương đương.
  •  Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDT : ly t m 3000 v ng/phút trong 5 phút.
  •  Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDTA n ng độ 1 x107/ml.

+ Tách huyết thanh người bệnh từ ống máu đông

+ Mẫn cảm tiểu cầu giá thể

+ Ủ 100 microlit tiểu cầu giá thể với huyết thanh chứng m, huyết thanh chứng dương và huyết thanh người bệnh theo sơ đồ sau

 

Ống số Tiểu cầu giá thể 

Huyết thanh chứng

Huyết thanh người bệnh

4 100 μl - -
5 100 μl 20 μl -
6 100 μl 20 μl -
7 100 μl - 20 μl
8 100 μl - 20 μl

 

- Ủ kháng thể

  •  Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn d ng theo sơ đồ sau Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ ph ng, tránh ánh sáng.

 

Ống số Tiểu cầu giá thể đã mẫn cảm huyết thanh người bệnh

Anti

CD61-PE

Anti mouse

IgG-PE

Anti mouse

IgG-FITC

Anti human

IgG-FITC

4 100 μl - 20 μl 20 μl -
5 100 μl 20 μl   20 μl  
6 100 μl 20 μl     20 μl
7 100 μl 20 μl   20 μl  
8 100 μl 20 μl     20 μl

 

  •  Sau ủ kháng thể, rửa b kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA, ly tâm 3000 v ng/phút x 5 phút. Đổ b dịch nỗi giữ lại cặn tế bào.
  •  Sau rửa, tái huyền dịch tiểu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDT và trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sang cho ph n tích.

3. Phân tích kháng thể kháng tiểu cầu trên máy flow cytometry

  •  Đưa các ống flow cytometry đã chuẩn bị ở trên (ống 1, 2...5, 6,7) vào vị trí đọc trên máy.
  •  Mở chương tr nh ph n tích kháng thể kháng tiểu cầu đã l p sãn trên máy. Nh p vị trí ống ph n tích và chạy chương tr nh phần mềm ph n tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

  •  Quan sát trên quần thể tiểu cầu (quần thể dương tính với CD61).
  •  Dùng các ống nhuộm anti mouse IgG làm chuẩn ngưỡng m tính cho từng kênh màu và từng nghiệm ống mẫu x t nghiệm (ống 1 và 4 để lấy chuẩn kênh mầu FITC và PE, ống 2 làm ngưỡng m cho ống 3, ống 5 làm ngưỡng m cho ống 6, ống 7 làm ngưỡng m cho ống 8).
  •  Nếu ống 3 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thể kháng tiểu cầu tr c tiếp dương tính (có kháng thể trên bề mặt tiểu cầu người bệnh).
  •  Nếu ống 6 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Hệ thống x t nghiệm tốt, chứng dương c n hoạt động.
  •  Nếu ống 8 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp dương tính (có kháng thể kháng tiểu cầu t do trong huyết thanh người bệnh).

=> Bình thường : Tất cả các ống đều m tính với anti human IgG.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x t nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu ống citrate natri bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

  • Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thong tin cần thiết, nếu mẫu bị đông phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Không thấy quần thể dương tính với CD61 trên flow cytometry. Nguyên nhân có thể do kháng thể anti CD61 k m chất lượng; kĩ thuậtt ly tâm tách tiểu cầu làm chưa đúng; k thu t rửa tiểu cầu không đúng.

  • Xử trí: làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng quy trình.

- Không thấy có quần thể tế bào khi chạy flow cytometry: có thể do máy không đủ áp lực; tắc kim hút, có bọt khí trong đường dẫn dịch.

  • Xử trí: Kiểm tra lại máy, nếu cần phải rửa máy, đuổi bọt khí và thong kim hút theo hướng dẫn đi theo máy.
Bài viết nghiên cứu có thể bạn quan tâm
Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH với tiêu bản Parafin - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Định lượng kháng thể kháng β2- glycoprotein I IgG - IgM bằng kỹ thuật hóa miễn dịch phát quang - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Định lượng kháng thể kháng Cardiolipin IgM - IgG bằng kỹ thuật hóa miễn dịch phát quang - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Xác định kháng nguyên Mia của hệ nhóm máu MNS (kỹ thuật ống nghiệm) - Bộ y tế 2017
  •  2 năm trước

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Dị ứng - Sinh học phân tử - Bộ y tế 2017

Tin liên quan
Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt) cho biết điều gì?
Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt) cho biết điều gì?

Xét nghiệm PSA rất nhạy và có thể phát hiện mức PSA cao hơn bình thường. Nồng độ PSA cao có thể là dấu hiệu của ung thư tuyến tiền liệt. Do đó, xét nghiệm PSA giúp phát hiện ung thư từ trước khi xuất hiện các triệu chứng thực thể.

Ung thư tuyến tiền liệt kháng cắt tinh hoàn là gì và điều trị bằng cách nào?
Ung thư tuyến tiền liệt kháng cắt tinh hoàn là gì và điều trị bằng cách nào?

Trong những trường hợp bệnh ung thư tuyến tiền liệt tiến triển và trở nên kháng cắt tinh hoàn, còn nhiều phương pháp điều trị khác có thể giúp làm chậm sự tiến triển của bệnh, mặc dù các phương pháp này không thể chữa khỏi ung thư. Mục tiêu điều trị chính là ngăn ung thư lan từ tuyến tiền liệt đến các bộ phận ở xa trong cơ thể như cột sống, phổi và não (di căn).

Điều trị són tiểu bằng thủ thuật treo cổ bàng quang
Điều trị són tiểu bằng thủ thuật treo cổ bàng quang

Treo cổ bàng quang là một giải pháp cho những trường hợp bị tiểu không tự chủ khi tăng áp lực nghiêm trọng, các triệu chứng gây cản trở cuộc sống hàng ngày và các phương pháp điều trị khác không hiệu quả.

Tại sao đã điều trị bằng kháng sinh mà nhiễm trùng đường tiết niệu vẫn không khỏi?
Tại sao đã điều trị bằng kháng sinh mà nhiễm trùng đường tiết niệu vẫn không khỏi?

Nếu các triệu chứng nhiễm trùng đường tiết niệu vẫn kéo dài sau khi điều trị thì có thể phải điều trị bằng một loại thuốc khác hoặc cũng có thể các triệu chứng là do một bệnh lý khác gây ra.

Các loại thuốc kháng cholinergic để điều trị bàng quang tăng hoạt
Các loại thuốc kháng cholinergic để điều trị bàng quang tăng hoạt

Nếu bạn thường xuyên đi tiểu nhiều lần, buồn tiểu đột ngột và bị rò rỉ nước tiểu khi chưa kịp vào nhà vệ sinh thì rất có thể bạn đã bị hội chứng bàng quang tăng hoạt (OAB). Theo Mayo Clinic, đi tiểu nhiều lần được định nghĩa là đi tiểu từ tám lần trở lên trong khoảng thời gian 24 giờ. Nếu bạn thường phải thức giấc nhiều lần vào ban đêm để đi vệ sinh thì nguyên nhân có thể là do bàng quang tăng hoạt. Tuy nhiên, còn nhiều lý do khác gây tình trạng tiểu nhiều vào ban đêm, ví dụ như do những thay đổi ở thận do quá trình lão hóa hay do uống quá nhiều nước vào buổi tối.

Hỏi đáp có thể bạn quan tâm
Trẻ bú trực tiếp sữa của người khác thì có bị lây bệnh truyền nhiễm của người đó không?
  •  3 năm trước
  •  1 trả lời
  •  595 lượt xem

Vợ em sinh mổ 1 bé trai và 1 bé gái tại bệnh viện Từ Dũ. Khi sinh ra vì mẹ không đủ sữa nên nhà em sốt ruột đã cho 2 bé bú sữa trực tiếp của 1 chị cùng phòng sanh. Nếu chị kia bị bệnh truyền nhiễm thì hai bé nhà em có bị lây không ạ? Và khi nào thì các bé có thể làm xét nghiệm để biết bé có bị bệnh truyền nhiễm gì không?

Tiểu đường thai kỳ có lặp lại khi mẹ mang bầu lần tiếp theo?
  •  3 năm trước
  •  1 trả lời
  •  593 lượt xem

Em đang có một bé gái 6 tuổi, hiện đã qua 2 lần sinh mổ. Bé thứ 2 được 25 tuần thì em bị tiểu đường, phải chích insulin sáng chiều và đến tuần 36 thì bé mất. Em có tiền sử bị tiểu đường như vậy, lần này nếu mang thai liệu có bị tiểu đường và sinh mổ lần nữa có sao không?

Có nên mua sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa và sữa non hỗ trợ tăng sức đề kháng cho bé quảng cáo ở trên mạng không?
  •  3 năm trước
  •  1 trả lời
  •  360 lượt xem

Bé nhà em hiện đang được 2 tháng 15 ngày tuổi. Em cho bé bú sữa công thức là chủ yếu vì em rất ít sữa. Em có tham khảo trên mạng thì thấy có nhiều sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa hay sữa non hỗ trợ tăng sức đề kháng cho bé. Không biết em có nên mua cho bé dùng không ạ?

Vừa sinh xong cho trẻ bú bình hay bú trực tiếp vú mẹ tốt hơn?
  •  3 năm trước
  •  1 trả lời
  •  587 lượt xem

Em vừa sinh bé xong thì nên vắt sữa ra bình hay cho bé bú trực tiếp vú mẹ ạ? Thời điểm tốt nhất để cho bé bú bình là khi nào ạ?

Dùng thuốc kháng vi rút như Tamiflu để điều trị cúm ở bà bầu có an toàn không?
  •  4 năm trước
  •  1 trả lời
  •  827 lượt xem

- Bác sĩ ơi, tôi dùng thuốc kháng vi rút như Tamiflu để điều trị cúm ở bà bầu có an toàn không ạ? Cảm ơn bác sĩ!

Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây