Xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp và gián tiếp bằng kỹ thuật flow cytometry - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

•  Trên bề mặt tiểu cầu có các kháng nguyên tiểu cầu HP , kháng nguyên bạch cầu HL và kháng nguyên nhóm máu BO. Trong những điều kiện nhất định, có thể có thể sinh các t kháng thể chống lại các kháng nguyên tiểu cầu của chính m nh (bệnh giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc sinh kháng thể đ ng loại chống các kháng nguyên tiểu cầu truyền vào. Các kháng thể kháng tiểu cầu có thể t n tại t do trong huyết tương hoặc đã gắn trên bề mặt tiểu cầu.Hầu hết các kháng thể này là kháng thể miễn dịch có bản chất là IgG.
•  Dùng kháng thể đơn d ng gắn huỳnh quang kháng IgG người có thể phát hiện được kháng thế kháng tiểu cầu tr c tiếp (kháng thể đã gắn lên tiểu cầu) hoặc kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp (kháng thể t do trong huyết tương).

II. CHỈ ĐỊNH

• Người bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu nghi do miễn dịch;
• Người bệnh truyền máu, tiểu cầu nhiều lần;
• Người bệnh truyền tiểu cầu không hiệu l c.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  Kỹ thuật viên, cử nh n đã được đào tạo th c hiện k thu t;
•  Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện hóa chất

2.1. Phương tiện

• Máy ph n tích tế bào d ng chảy (máy flow cytometry);
• Máy ly tâm;
• Máy lắc trộn (máy votex);
• Pipet và đầu pipet các loại 250 và 1.000 microlit;
• Các ống nghiệm chuyên d ng cho flow cytometry;
• Găng tay làm x t nghiệm.

2.2. Hóa chất

•  Anti CD61-PE;
•  Anti human IgG-FITC;
•  Anti human IgM-FITC;
•  Dung dịch PBS-EDTA;
•  Dung dịch sheath chạy máy flow;
•  Nước cất, hóa chất khử trùng Natri hypoclorite;
•  Mẫu chứng âm: lag mẫu huyết thanh người không có kháng thể kháng tiểu cầu;
•  Mẫu chứng dương: là mẫu huyết thanh người có kháng thể kháng tiểu cầu;
•  5 mẫu tiểu cầu của người cho máu cùng nhóm BO với người bệnh.

3. Bệnh phẩm

Cần 2 mẫu máu (1 mẫu chống đông natri citrate, 1 mẫu đông) lấy từ người bệnh có chỉ định làm x t nghiệm.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

•  Người bệnh: 2 ml máu chống đông bằng natri citrate; 2 ml máu đông;
•  5 mẫu tiểu cầu người cho cùng nhóm BO của người bệnh (lấy từ các d y tiểu cầu của túi tiểu cầu trong ng n hàng máu;
•  Mẫu chưa làm ngay có thể giữ trong tủ lạnh 2-8oC trong v ng 3 ngày.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp

- Chuẩn bị bệnh phẩm

•  Ly tâm ống máu người bệnh chống đông bằng natri citrate để tách huyết tương giầu tiểu cầu: ly t m 500 v ng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ thường.
•  Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDT : ly t m 3000 v ng/phút trong 5 phút.
•  Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDT n ng độ 1 x107/ml.

- Ủ kháng thể

•  Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn dòng theo sơ đồ sau. Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ ph ng, tránh ánh sang. Sơ đồ ủ mẫu như sau:

 

Ống số	Tiểu cầu BN	Anti CD61-PE	Anti mouse IgG-PE	Anti mouse IgG-FITC	Anti human IgG-FITC
1	100 μl	-	20 μl	20 μl
2	100 μl	20 μl		20 μl
3	100 μl	20 μl		-	20 μl

 

•  Sau ủ kháng thể, rửa b kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA, ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút. Đổ bỏ dịch nỗi giữ lại cặn tế bào.
•  Sau rửa, tái huyền dịch tiểu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDT và trộn đều.
• Lúc này ống đã sẵn sang cho ph n tích.

2.2. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp

- Chuẩn bị bệnh phẩm

+ Chuẩn bị tiểu cầu giá thể:

•  Trộn 5 mẫu tiểu cầu cùng nhóm BO người bệnh với tỷ lệ tương đương.
•  Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDT : ly t m 3000 v ng/phút trong 5 phút.
•  Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDTA n ng độ 1 x107/ml.

+ Tách huyết thanh người bệnh từ ống máu đông

+ Mẫn cảm tiểu cầu giá thể

+ Ủ 100 microlit tiểu cầu giá thể với huyết thanh chứng m, huyết thanh chứng dương và huyết thanh người bệnh theo sơ đồ sau

 

Ống số	Tiểu cầu giá thể	Huyết thanh chứng	Huyết thanh người bệnh
4	100 μl	-	-
5	100 μl	20 μl	-
6	100 μl	20 μl	-
7	100 μl	-	20 μl
8	100 μl	-	20 μl

 

- Ủ kháng thể

•  Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn d ng theo sơ đồ sau Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ ph ng, tránh ánh sáng.

 

Ống số	Tiểu cầu giá thể đã mẫn cảm huyết thanh người bệnh	Anti CD61-PE	Anti mouse IgG-PE	Anti mouse IgG-FITC	Anti human IgG-FITC
4	100 μl	-	20 μl	20 μl	-
5	100 μl	20 μl		20 μl
6	100 μl	20 μl			20 μl
7	100 μl	20 μl		20 μl
8	100 μl	20 μl			20 μl

 

•  Sau ủ kháng thể, rửa b kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA, ly tâm 3000 v ng/phút x 5 phút. Đổ b dịch nỗi giữ lại cặn tế bào.
•  Sau rửa, tái huyền dịch tiểu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDT và trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sang cho ph n tích.

3. Phân tích kháng thể kháng tiểu cầu trên máy flow cytometry

•  Đưa các ống flow cytometry đã chuẩn bị ở trên (ống 1, 2...5, 6,7) vào vị trí đọc trên máy.
•  Mở chương tr nh ph n tích kháng thể kháng tiểu cầu đã l p sãn trên máy. Nh p vị trí ống ph n tích và chạy chương tr nh phần mềm ph n tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

•  Quan sát trên quần thể tiểu cầu (quần thể dương tính với CD61).
•  Dùng các ống nhuộm anti mouse IgG làm chuẩn ngưỡng m tính cho từng kênh màu và từng nghiệm ống mẫu x t nghiệm (ống 1 và 4 để lấy chuẩn kênh mầu FITC và PE, ống 2 làm ngưỡng m cho ống 3, ống 5 làm ngưỡng m cho ống 6, ống 7 làm ngưỡng m cho ống 8).
•  Nếu ống 3 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thể kháng tiểu cầu tr c tiếp dương tính (có kháng thể trên bề mặt tiểu cầu người bệnh).
•  Nếu ống 6 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Hệ thống x t nghiệm tốt, chứng dương c n hoạt động.
•  Nếu ống 8 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp dương tính (có kháng thể kháng tiểu cầu t do trong huyết thanh người bệnh).

=> Bình thường : Tất cả các ống đều m tính với anti human IgG.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x t nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu ống citrate natri bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

• Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thong tin cần thiết, nếu mẫu bị đông phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Không thấy quần thể dương tính với CD61 trên flow cytometry. Nguyên nhân có thể do kháng thể anti CD61 k m chất lượng; kĩ thuậtt ly tâm tách tiểu cầu làm chưa đúng; k thu t rửa tiểu cầu không đúng.

• Xử trí: làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng quy trình.

- Không thấy có quần thể tế bào khi chạy flow cytometry: có thể do máy không đủ áp lực; tắc kim hút, có bọt khí trong đường dẫn dịch.

• Xử trí: Kiểm tra lại máy, nếu cần phải rửa máy, đuổi bọt khí và thong kim hút theo hướng dẫn đi theo máy.