Quy trình xác nghiệm gen bằng kỹ thuật cIg FISH - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

• Kỹ thuật cIg FISH là sự phối hợp 2 kĩ thuậtt là nhuộm bào tương của tế bào plasmo (tương bào) và k thu t FISH.
• Kỹ thuật nhuộm bào tương của tế bào plasmo được tiến hành theo nguyên lý: bào tương của tế bào plasmo biểu hiện rất nhiều kháng thể có chuỗi nhẹ kappa hoặc lambda. Sử dụng các kháng kháng thể đơn d ng (anti-kappa hoặc anti-lambda) đã được gắn huỳnh quang để nhuộm bào tương của tương bào sẽ giúp xác định dễ dàng các tế bào này thông qua kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc phù hợp
• Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng ph n tử k p g m 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, ph n tử DN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung.
• Dựa trên đặc tính này, k thu t FISH sử d ng các probe là đoạn DN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai gh p với các đoạn DN tương đ ng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.
• Sử dụng kỹ thuật cIg FISH giúp đánh giá những tổn thương di truyền khu trú trên d ng tế bào plasmo ác tính nên tránh được m tính giả.

II.CHỈ ĐỊNH

Chỉ định cho người bệnh đa u tủy xương, các bệnh lý liên quan đến tế bào lympho B.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Nhân viên xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử đã được đào tạo.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

•  Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly t m, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
•  Dụng cụ : kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.

2.2. Hóa chất

• Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện.
• Dung dịch 10% formamide: 5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC.
• Dung dịch 2X SSC.
• Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40.
• Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40.
• Cồn 70o, 85o, 100o.
• Ficoll Paque.
• Dung dịch PBS 1X.
• Dung dịch SSC 20X.
• Dung dịch nhược trương: KCL 0,075M (PH=7,4). (5 ml/1 mẫu).
• Methanol tuyệt đối.
• Acid acetic.
• Mounting medium without DAPI.
• AMCA Goat Anti human lambda chain antibody.
• AMCA Goat Anti human kappa chain antibody.
• AMCA Rabbit Anti goat IgG antibody.
• LSI/WCP Hybridization Buffer.

3. Bệnh phẩm

2 ml dịch hút tủy xương của người bệnh đ ng trong ống chống đông Sodium heparin.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Chuẩn bị tiêu bản

Sau khi có dịch hút tủy xương của người bệnh, cần tiến hành k o tiêu bản và phân tích tỷ lệ tương bào. Với những mẫu có tỷ lệ tương bào lớn hơn 10%, thực hiện các bước chuẩn bị tiêu bản như sau:

B1: Tách tế bào đơn nh n bằng ficoll:

•  Cho toàn bộ dịch tủy của người bệnh vào ống falcon 15 ml. Cho thêm dung dịch PBS 1X đến 3,3 ml.
•  Thêm 1ml ficoll vào (lưu ý cho đầu côn chứa ficoll xuống đáy ống falcon). Ly t m 2100 v ng/phút trong 30 phút với chế độ “ no brake” cho máy ly tâm.
•  Dùng pipet để b phần huyền dịch phía trên chứa huyết tương và tiểu cầu. Sử d ng pipet khác để chuyển phần tế bào đơn nh n sang ống falcon khác.
•  Rửa bằng cách cho thêm PBS vào phần tế bào đơn nh n theo tỷ lệ 3:1. Ly t m 1400 v ng/phút trong 10 phút.
•  Tái huyền dịch bằng PBS.

B2. Nhược trương tế bào:

• Xử lý tế bào đơn nh n bằng 5ml dung dịch KCl 0,075M trong 5 phút. Sau đó cho thêm 01 ml dung dịch Cornoy II (3 methanol: 1 acid acetic), trộn đều r i đem ly tâm 1000 v ng/phút trong 10 phút.
• Loại b dịch nổi.

B3. Cố định tiêu bản:

•  Cho thêm 5ml dung dịch Cornoy II. Để ở nhiệt độ ph ng trong 10 phút.
•  Ly t m 1000 v ng/phút trong 10 phút.
•  Loại b dịch nổi.
•  Cho thêm 5 ml cồn 96o. Ly t âm 1000 v ng/phút trong 10 phút.
•  Tái huyền dịch để có n ng độ tế bào phù hợp, nh cặn tế bào lên lam kính.

2. Lai huỳnh quang tại chỗ

2.1. Xử lý tiêu bản

•  Ngâm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37±1oC trong 15 phút.
•  Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
•  Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút.
•  Chuyển tiêu bản qua cóng chứa c n 700 trong 1 phút.
•  Chuyển tiêu bản qua cóng chứa c n 850 trong 1 phút.
•  Chuyển tiêu bản qua cóng chứa c n 1000 trong 1 phút.
•  Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ ph ng.

2.2. Chuẩn bị probe

•  Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2 μl dH2O) /1tiêu bản
•  Ly tâm nhẹ.

2.3.Lai

•  Nhỏ 10 μl dung dịch probe vào khu v c đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
•  Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
•  Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương tr nh biến tính ở 73oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.

2.4. Rửa sau khi lai

- Gỡ b xi măng cao su và coverslip.

- Ng m và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau:

•  Dung dịch (0,4X SSC/ 0,3% NP40): 2 phút, 73oC.
•  Dung dịch (2X SSC/ 0,1% NP40): 1phút, nhiệt độ ph ng.

- Làm khô tiêu bản.

3. Nhuộm kháng thể tương bào

•  Chuẩn bị 20 μl kháng kháng thể Kappa và Lambda/ tiêu bản (2 μl MC ntiHuman Kappa: 2 μl MC nti-Human Lambda : 16 μl PBS 1X).
•  Nh 20 μl kháng kháng thể Kappa và Lambda lên bề mặt tiêu bản. Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Ủ trong tối ở 37oC tối thiểu 20 phút.
•  Rửa qua 2 cóng chứa PBS 1X trong 2 phút mỗi cóng.
•  Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ ph ng.
•  Chuẩn bị 20 μl kháng kháng thể Ig (H+L)/ tiêu bản (1 μl MC nti-Goat Ig (H+L): 19 μl PBS 1X).
•  Nh 20 μl kháng kháng thể Ig (H+L) lên bề mặt tiêu bản. Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Ủ trong tối ở 37oC tối thiểu 20 phút.
•  Rửa qua 2 cóng chứa PBS 1X trong 2 phút mỗi cóng.
•  Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ ph ng.

4. Phân tích kết quả

•  Nh 10-20 μl dung dịch antifade lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và ổn định tín hiệu D PI trên tương bào.
•  Phủ kín tiêu bản bằng coverslip. Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.
•  Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc thích hợp.
•  Quy tắc ph n tích theo hướng dẫn c thể của nhà sản xuất cho từng loại probe. Thông thường sẽ tiến hành ph n tích 100 tương bào để đưa ra kết quả cuối cùng.

VI. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ