Kỹ thuật sinh thiết phôi trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ - Bệnh viện Từ Dũ

Giới thiệu về chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ

Chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD – Preimplantation Genetic Diagnosis) là kỹ thuật dùng để xác định các rối loạn về gen di truyền hay bất thường trong bộ nhiễm sắc thể của giao tử hay phôi ở giai đoạn trước khi phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ.

Quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ bao gồm hai giai đoạn chính là sinh thiết và chẩn đoán di truyền. Bài viết này giới thiệu về các kỹ thuật sinh thiết và ảnh hưởng của sinh thiết lên sự phát triển của phôi cũng như của các em bé ra đời từ kỹ thuật này.

Kỹ thuật sinh thiết trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ là gì?

Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) bao gồm các giai đoạn kích thích buồng trứng, chọc hút trứng, thụ tinh trứng với tinh trùng, sau đó phôi được nuôi cấy và chuyển vào buồng tử cung người mẹ.

Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước làm tổ có thể được thực hiện ở 3 giai đoạn khác nhau:

• Sinh thiết trước và ngay sau khi trứng thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ nhất và thứ hai)
• Sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt (ngày thứ 3 sau thụ tinh)
• Sinh thiết ở giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5 sau thụ tinh).

Mỗi giai đoạn sinh thiết đều mang ưu điểm, khuyết điểm cũng như chỉ định riêng. Qui trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngược được gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi. Sau đó trứng hay phôi sẽ tiếp tục được nuôi cấy, mẫu vật được cố định để chẩn đoán di truyền.

Yêu cầu kỹ thuật khi thực hiện sinh thiết

1. Chuẩn bị trước sinh thiết

Các tế bào ngoại lai như tinh trùng, tế bào viền (cumulus cells) cần được làm sạch trước khi sinh thiết nhằm tránh chẩn đoán nhầm DNA của các tế bào này. Do vậy, những bệnh nhân có chỉ định thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ cần được thực hiện TTTON bằng phương pháp ICSI (bơm tinh trùng vào bào tương trứng).

Danh tính của trứng, phôi và mẫu vật cũng cần được xác định chính xác và kiểm tra ít nhất hai lần ở mỗi khâu trong suốt quá trình thực hiện nhằm đảm bảo kết quả chẩn đoán di truyền của mẫu vật được liên hệ chính xác đến trứng hay phôi tương ứng.

Môi trường nuôi cấy và sinh thiết cũng đóng vai trò quan trọng nhằm đảm bảo sự phát triển tiếp theo của phôi. Môi trường sinh thiết giúp quá trình thao tác dễ dàng hơn. Một trong những môi trường quan trọng đó là môi trường không có Ca2+ và Mg2+ (Ca2+ và Mg2+ free medium).

Sau đó, phôi cần được nuôi cấy bằng hệ thống chuỗi môi trường tùy thuộc giai đoạn phát triển (ví dụ như hệ thống môi trường G1, G2 (Vitrolife, Sweden) và được nuôi trong tủ cấy 3 loại khí (5% O2, 6% CO2, 89 %N2) nhằm đảm bảo quá trình phát triển tối ưu của phôi.

Vai trò môi trường không có Ca2+ và Mg2+ trong sinh thiết phôi:

Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình sinh thiết phôi sẽ dễ dàng hơn khi phôi được ủ trong môi trường không có Ca2+ và Mg2+ vài phút trước khi tiến hành sinh thiết. Ca2+ và Mg2+ đóng vài trò quan trọng trong cấu tạo các liên kết ở màng ngoài các phôi bào.

Một trong các liên kết này là Cadherin, đã bắt đầu được hình thành khi phôi giai đoạn 6 phôi bào (khoảng ngày thứ 3 sau thụ tinh), để đến ngày thứ 4, tất cả các phôi bào sẽ liên kết và nén chặt lại thành một khối thống nhất (compaction).

Cadherin là protein gồm 2 thành phần: phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là polypeptid gồm có 5 đồng phân. Các đồng phân này gắn kết với nhau tại các vị trí gắn kết Ca2+ (Ca2+ binding sites) và cũng từ đó gắn kết với các đồng phân cadherin của tế bào lân cận. Nếu môi trường xung quanh tế bào có nồng độ Ca2+ cao thì phần ngoài của chuỗi cadherin sẽ cứng chắc và mất tính đàn hồi. Ngược lại, nếu môi trường xung quanh tế bào có ít Ca2+ thì phần ngoài của chuỗi cadherin sẽ gắn kết lòng lẻo hơn và dễ bị ly giải bởi các men ly giải protein. 

2. Mở cửa sổ màng zona pellucida (zona pellucida opening)

Là phương pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi (zona pellucida) và từ vị trí ấy, kim sinh thiết được đưa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài. Có 3 phương pháp chính được dùng để mở cửa sổ màng zona:

• Phương pháp cơ học
• Hóa học
• Dùng tia laser.

Phương pháp cơ học thường được dùng trong sinh thiết thể cực nhưng tương đối phức tạp. Trong khi đó, sử dụng dung dịch acid Tyrode’s trong phương pháp hóa học đơn giản hơn nhưng tỷ lệ phôi bào bị ly giải do bị tiếp xúc với dung dịch acid tương đối cao (11%; Inzunza et al.,1998).

Hiện nay, dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona được xem là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng nhất. Đã có nhiều nghiên cứu so sánh 3 phương pháp trên về hiệu quả lâm sàng cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, nhưng nhìn chung kết quả phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, kỹ năng cũng như sự khéo léo của người thực hiện.

Màng zona có vai trò quan trọng trong sự phát triển của nang noãn, sự thụ tinh, chống hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng, đồng thời có vai trò như một vỏ bảo vệ phôi khi phôi di chuyển từ vị trí thụ tinh ở tai vòi vào buồng tử cung để làm tổ. Màng zona có cấu trúc là chất nền glycoprotein (glycoprotein matrix), carbonhydrate và protein chuyên biệt của màng zona với bề dày bình thường là 13-15 µm.

Độ dày màng zona sẽ mỏng dần tương ứng với sự phát triển của phôi, và đến ngày 5-6 sau thụ tinh, màng zona sẽ vỡ ra để phôi thoát ra ngoài (hatching). Quá trình thoát màng chịu ảnh hưởng của 3 yếu tố chính: sự tăng trưởng của khối tế bào phôi ở giai đoạn phôi nang, sự tiết men ly giải màng zona của phôi bào và tế bào nội mạc tử cung.

Thực nghiệm cho thấy tỷ lệ làm tổ của phôi tăng sau mở cửa sổ màng zona khi phôi ở giai đoạn phân cắt. Nguyên nhân có thể là do quá trình này đã kích thích phôi bào tăng sản xuất men ly giải màng zona. 

3. Sinh thiết mẫu vật

Sinh thiết thể cực

Sau khi mở cửa sổ màng zona, kim sinh thiết được đưa qua cửa sổ để vào khoang dưới màng zona (perivitelline space). Đường kính trong của kim sinh thiết phụ thuộc vào loại mẫu vật muốn sinh thiết. Với sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt, đường kính trong của kim sinh thiết thường từ 35-40 µm. Có hai phương pháp chính để lấy mẫu vật ra ngoài.

Thứ nhất là tạo áp lực âm trong kim sinh thiết để hút phôi bào vào kim sinh thiết. Phôi bào có thể được hút toàn bộ hay một phần. Nếu phôi bào chỉ được hút một phần vào kim thì cần có thêm lực kéo để nhẹ nhàng vừa hút vừa kéo phôi bào ra ngoài. Cách này thường được ứng dụng nhiều nhất trên lâm sàng.

Phương pháp thứ hai, ít được sử dụng hơn, là tạo một áp lực dương từ kim sinh thiết (ví dụ như đẩy môi trường vào khoang dưới màng zona, vặn xoắn bên ngoài màng zona) để đẩy phôi bào ra cửa sổ màng zona. Đối với sinh thiết phôi nang, khoảng 10-30 “tế bào ngoài” của phôi (trophectoderm) được hút ra ngoài qua cửa sổ màng zona, sau đó liên kết giữa khối tế bào bên ngoài và bên trong sẽ được cắt bằng phương pháp cơ học hay bằng tia laser.

Phương pháp sinh thiết thể cực được xem là phương pháp ít gây tổn hại, ít ảnh hưởng đến sự sống và chất lượng của trứng và phôi nhất.

Tuy nhiên, kết quả chẩn đoán di truyền thể cực chỉ phản ánh sự bất thường di truyền của người mẹ mà thiếu đi thông tin di truyền của người cha và của phôi. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền phôi ở giai đoạn phôi nang được xem là kỹ thuật mang lại kết quả di truyền chính xác nhất hiện nay với ưu điểm là nhiều tế bào được sinh thiết và chẩn đoán. 

Hiệu quả chẩn đoán di truyền

Kể từ khi ra đời năm 1990, phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ đã được thực hiện tại nhiều trung tâm điều trị hiếm muộn trên thế giới. Kết quả một nghiên cứu đoàn hệ được thực hiện trong vòng 7 năm (1992-2005) đánh giá sức khỏe của các em bé ra đời bằng phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ ở phôi ngày thứ 3 sau ICSI cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ đa thai, tuổi thai, cân nặng và tỷ lệ bất thường lớn (major malformation rates) sau sinh của 581 em bé ra đời từ pháp này trong số 2889 em bé ra đời bằng phương pháp ICSI đơn thuần. 

Kết luận

Phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ nhằm giúp lựa chọn phôi không mang một số bất thường di truyền xác định. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền là hai quá trình quan trong trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ.

Thể cực, phôi bào hay tế bào ngoài phôi có thể được sinh thiết để chẩn đoán di truyền tùy theo từng chỉ định cụ thể. Nhiều nghiên cứu trong vòng 20 năm qua cho thấy quá trình sinh thiết 1 phôi bào không làm ảnh hưởng đến khả năng làm tổ cũng như sự phát triển của các em bé sinh ra từ phương pháp này.

Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng ở diện rộng hơn nhằm đánh giá chính xác hiệu quả của phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ.

Nguồn: Bệnh viện Từ Dũ