Định lượng TNFα (Tumor necrosis factor alph ) - Bộ y tế 2018

I. NGUYÊN LÝ

- Yếu tố hoại tử khối u α (cachectin) và yếu tố hoại tử khối u α (lymphotoxin) là hai protein có liên quan mật thiết có tính tương đồng về trình tự chung nhau 34% ở trình tự axít amin. Cả hai chất trung gian hoạt động trên các tế bào đích thông qua cùng thụ thể và vì vậy cho thấy tác dụng sinh học tương tự, nhưng không giống nhau hoàn toàn. Dưới điều kiện không biến tính, TNFα là một protein 17 kDa, không glycosyl hóa. Dạng có hoạt tính sinh học của TNFα là một chất tam trùng phân. Bên cạnh dạng có thể hòa tan của TNFα, dạng 28 kDa gắn kết màng có trên bề mặt của tế bào sản xuất TNF, dạng này có thể đóng vai trò như là một nguồn trữ TFNα có thể hòa tan và có thể được cắt khỏi bề mặt tế bào theo cách thủy phân protein. Các tế bào sản sinh ra TNFα như đại thực bào, tế bào T CD4+, ...Ngoài ra, tế bào cơ trơn, bạch cầu trung tính đa nhân, tế bào hình sao, tế bào mô mỡ, từ nội mạc mạch máu và nhiều dòng tế bào khối u khác có thể sản sinh ra TNFα. TNF cũng được tạo ra từ đại thực bào trong cơ thể như một tiền hóc môn không hoạt động và được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên, các tế bào u hắc tố, và một vài dòng tế bào ung thư.

- Vì thụ thể TNFα xuất hiện trên hầu hết các tế bào, TNFα có nhiều hoạt động sinh học đa dạng như: tiêu tế bào, kìm các tế bào khối u và hoạt tính hóa hướng động ở các bạch cầu trung tính. TNFα là một yếu tố tăng trưởng của nguyên bào sợi và kích thích việc tổng hợp collagenase và prostaglandin E2 sự tái hấp thụ xương có thể do TNFα gây ra vì nó kích hoạt hủy cốt bào. TNFα thúc đẩy việc phân chia của tế bào T sau khi kích thích bằng IL-2. Khi không có IL-2, TNFα gây cảm ứng quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào beta. Nồng độ của TNFα trong huyết thanh hoặc huyết tương có thể tăng lên trong nhiễm trùng huyết, các bệnh tự miễn, nhiều bệnh nhiễm trùng khác nhau và thải loại mảnh ghép

- Nguyên lý xét nghiệm

• TNFα là một xét nghiệm miễn dịch tự động, 2 chu kỳ và dựa trên nguyên lý hoá phát quang. Trong chu kỳ đầu tiên, mẫu được ủ với pha rắn là các hạt được phủ kháng thể kháng TNFα, sản xuất từ chuột trong 30 phút. Sau đấy, rửa để loại bỏ mẫu cặn. Trong chu kỳ thứ 2, chất cộng hợp là kháng thể đa dòng kháng TNFα, sản xuất từ thỏ được cho vào cóng phản ứng, để tạo nên phức hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng thể. Sau đấy, rửa để loại bỏ phản ứng không đặc hiệu. Cuối cùng, cơ chất phát quang được thêm vào ống phản ứng và cường độ tín hiệu ánh sáng phát ra có thể đo được bằng bộ phận nhận quang. Kết quả được tính toán dựa vào đường cong chuẩn thu được bằng cách chuẩn 2 điểm và đường cong gốc được cung cấp từ nhà sản xuất. Nồng độ chất cần định lượng tỉ lệ thuận với cường độ ánh sáng thu được. Thời gian ra kết quả: 60 phút.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

• 01 cán bộ đại học có thẩm quyền ký kết quả.
• 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh hoặc người thực hiện phân tích có trình độ phù hợp, đã được đào tạo sử dụng máy hóa sinh tự động

2. Phương tiện hóa chất

2.1.Phương tiện

•  Máy miễn dịch tự động có thể phân tích: IMMULITE 1000, ...
•  Máy ly tâm
•  Tủ lạnh để bảo quản hóa chất, chất hiệu chuẩn, QC và mẫu bệnh phẩm
•  Ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm

2.2.Hoá chất

- Hóa chất được cung cấp trong hộp thuốc

•  Hóa chất TNFα (pha rắn): các hạt được phủ kháng thể kháng TNF, sản xuất từ chuột. Ổn định 2–8 °C cho đến ngày hết hạn ghi trên hộp thuốc.
•  Hóa chất TNFα (chất cộng hợp): kháng thể đa dòng kháng TNF, sản xuất từ thỏ. Ổn định 2–8 °C cho đến ngày hết hạn ghi trên hộp thuốc.
•  Chất hiệu chuẩn TNFα nồng độ thấp & nồng độ cao.

- Hóa chất cần thiết nhưng không được cung cấp trong hộp thuốc

•  QC các xét nghiệm Cytokine, 2 mức nồng độ, làm từ huyết thanh người
•  Cơ chất hóa phát quang
•  Dung dịch pha loãng mẫu (trong trường hợp nồng độ vượt quá khoảng tuyết tính)
•  Dung dịch rửa kim hút
•  Dung dịch làm sạch kim hút
•  Giá chứa cốc đựng mẫu có barcode
•  Cốc đựng mẫu (dùng 1 lần)
•  Nắp cốc đựng mẫu (tùy chọn)

3. Người bệnh

• Cần giải thích cho người bệnh và người nhà người bệnh hiểu về mục đích của việc lấy máu làm xét nghiệm

4. Phiếu xét nghiệm

•  Phiếu xét nghiệm theo đúng quy định của Bộ Y tế và bệnh viện
•  Trên phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin của người bệnh: họ và tên, tuổi, giới tính, số giường, khoa phòng, chẩn đoán, xét nghiệm cần làm.
•  Trên phiếu xét nghiệm cần có: chữ ký và họ tên bác sĩ chỉ định xét nghiệm, họ tên người lấy mẫu, thời gian chỉ định xét nghiệm và thời gian lấy mẫu bệnh phẩm.

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

•  Có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm huyết thanh hoặc huyết tương. Lấy 3 mL máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông hoặc ống có chất chống đông thích hợp như lithium heparin, EDTA,..
•  Mẫu được tiến hành phân tích ngay theo quy trình.
•  Bệnh phẩm được tách huyết thanh, huyết tương để ổn định 2-80C trong 2 ngày hoặc 6 tháng ở -200C

2. Tiến hành kỹ thuật

•  Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để thực hiện phân tích mẫu: Máy đã được cài đặt chương trình xét nghiệm TNF. Máy đã được chuẩn với xét nghiệm TNFα. Kết quả kiểm tra chất lượng với xét nghiệm TNF đạt yêu cầu: không nằm ngoài dải cho phép và không vi phạm luật kiểm tra chất lượng.
•  Người thực hiện phân tích mẫu nhập dữ liệu về thông tin người bệnh và chỉ định xét nghiệm vào máy phân tích hoặc hệ thống mạng (nếu có).
•  Thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm theo protocol của máy.
•  Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả sau đó in báo cáo hoặc ghi kết quả vào phiếu xét nghiệm để trả cho người bệnh

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

- Giá trị tham chiếu

• Cut-off: 8.1 pg/mL

- Tăng trong trường hợp

• Nồng độ TNF trong huyết tương hoặc huyết thanh tăng cao có thể trong trường hợp nhiễm khuẩn huyết, bệnh tự miễn, các bệnh nhiễm trùng và đào thải ghép tạng.
• Trong khi nồng độ TNF cao gây ra các triệu chứng giống sốc, tiếp xúc kéo dài với nồng độ TNF thấp có thể dẫn đến chứng suy nhược , hội chứng lãng phí. Điều này có thể được tìm thấy, ví dụ, ở bệnh nhân ung thư .

- Giảm trong trường hợp

• Người bệnh đang dùng thuốc ức chế TNF như Infliximab, Etanercept..

V. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ XỬ TRÍ

•  Mẫu sau khi được ly tâm cần được kiểm tra kỹ để không còn dấu vết của fibrin vì fibrin sẽ ảnh hưởng đến kết quả. Mẫu của người bệnh dùng thuốc chống đông có thể cần thời gian đông dài hơn. Mẫu không đảm bảo yêu cầu cần được loại bỏ và lấy mẫu bệnh phẩm mới để làm xét nghiệm.
•  Mẫu bị tan huyết có thể do việc xử lý không đúng cách trước khi gửi tới phòng xét nghiệm do đó kết quả của mẫu cần được phân tích với sự cẩn trọng.