BK virus đo tải lượng Real-time PCR - Bộ y tế 2018

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

• Phát hiện và đo số bản sao c a virus BK trong dịch não t y, huyết tương, máu toàn phần ho c nước tiểu c a người.

2. Nguyên lý

• Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
•  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

•  Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
•  Máy tách chiết acid nucleic.
•  Bộ lưu điện.
•  Máy nhiệt.
•  Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
•  Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút
•  T lạnh 20C -8 0C
•  T âm sâu (-200 C) ho c (-700C) (nếu có)
•  Máy vortex
•  T an toàn sinh học
•  Micropipettes các thể tích từ 0,5 l - 1000 l.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

•  Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

• Dịch não t y, huyết tương, máu toàn phần và nước tiểu.

4. Phiếu xét nghiệm

• Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

• Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

• BK virus PCR Kit (GeneProof – VD ho c tương đương)

2.1 Thu nhận và xử lí mẫu

• Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA nếu cần.

2.2 Tách chiết DNA:

• Tách chiết bằng tay ho c máy tự động.

2.3 Thực hiện phản ứng real-time PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh ho c đá đang tan.

- Bật máy real-time PCR. Bật máy tính kh i động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15 phút.

- Pha hóa chất:

•  Chuẩn bị đ số tube PCR cần dùng
•  Cho 30 ul MasterMix vào mỗi tube
•  Nhỏ 10 ul mẫu DNA đã tách chiết từ bệnh phẩm ho c mẫu chứng dương (gồm 4 nồng độ từ 101 đến 104), chứng âm vào các tube tương ứng. Tổng thể tích cuối cùng là 40 ul.
•  Ly tâm nhẹ ống rồi đ t vào máy real-time PCR theo vị trí đã cài đ t.

- Cài đ t vị trí mẫu “Plate setup” trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy real-time PCR.

- Chọn màu FAM cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX cho chứng nội.

- Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

- Lưu file dữ liệu vào máy tính

- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

- Giá trị định lượng chấp nhận được nếu cả 3 chứng: chứng âm, chứng dương và chứng nội có nghĩa. Các chứng có giá như sau:

•  Chứng âm: không phát hiện.
•  Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép c a nhà sản xuất (đ c hiệu với từng lô thuốc thử).
•  Chứng nội: với chứng âm và mẫu không phát hiện phải có tín hiệu lên ứng với Ct < 38.

- Ngược lại:

•  Chứng âm: Nếu chứng âm không hợp lệ thì phải thực hiện lại xét nghiệm cả chứng và toàn bộ lô bệnh phẩm.
•  Chứng dương: Nếu chứng dương không hợp lệ thì phải làm lại xét nghiệm toàn bộ mẻ chạy.
•  Chứng nội: không có tín hiệu lên với chứng âm và mẫu không phát hiện với Ct < 38 thì phải chạy lại mẫu đó.

2. Phân tích mẫu

- Đo tải lượng virus (VL) được tính toán sử dụng công thức sau:

• VL(copies/ml) = (SC x EV)/IV

- Trong đó:

• VL = giá trị định lượng (copies/ml)
• SC = nồng độ trong mẫu (sample concentration – cp/l)
• EV = thể tích thu mẫu (elution volume - l)
• IV = thể tích tách chiết (isolation volume - ml)

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sự cố:

• Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân:

• Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn g p sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.