Virus Real-time PCR - Bộ y tế 2018

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

• Xác định DNA ho c ARN đ t trưng c a virus cần tìm.

2. Nguyên lý

• Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
•  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

•  T an toàn sinh học cấp 2
•  Máy nhiệt
•  Máy ly tâm bàn dùng cho ống bệnh phẩm 5ml
•  Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml
•  Máy vortex
•  Máy chạy PCR
•  Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
•  Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000μl, 200μl, 100μl, 10μl
•  T lạnh thường
•  T âm sâu (-200C) ho c (-700C) (nếu có)
•  Bộ lưu điện

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

• Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

• Các loại bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm virus cần tìm

4. Phiếu xét nghiệm

• Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

• Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Thu nhận và xử lý mẫu:

• Tất cả loại bệnh phẩm khi chứa nhi u tạp nhiễm cần được thuần nhất trước khi tách chiết.

2.2. Tách chiết DNA hoặc RNA từ bệnh phẩm bằng bộ kit tách DNA tổng số hoặc RNA tổng số

2.3. Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên với virus có bộ gen là RNA (Bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản ứng RT-PCR)

•  Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR
•  Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh ho c đá đang tan.
•  Chỉ lấy đ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đ t phản ứng RT- PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
•  Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đ t các tube vào máy PCR.
•  Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn c a bộ kit RT-PCR.
•  Cho máy PCR chạy chương trình.

2.4 Chạy phản ứng Real-time PCR

•  Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và kh i động chương trình real-time PCR.
•  Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh ho c đá đang tan.
•  Chỉ lấy đ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đ t phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
•  Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch DNA vừa tách (ho c dịch cDNA vừa thu nhận được (ho c RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RT-PCR)) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đ t các tube vào máy real-time PCR.
•  Cài đ t vị trí mẫu “Plate setup” trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy real-time PCR.
•  Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn c a bộ kít sử dụng
•  Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
•  Lưu file dữ liệu vào máy tính
•  Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

•  Nhận định kết quả qua phân tích c a máy dựa trên cơ s hướng dẫn c a bộ kít Real-time PCR được sử dụng.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

•  Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
•  Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế ho c do máy Real- time PCR bị hỏng.
•  Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân th ch t chẽ quy trình kỹ thuật.