Dengue Virus Real-time RT-PCR - Bộ y tế 2018

Bác Sĩ Thúy

00:17 +07 Thứ tư, 17/08/2022

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh - Bộ y tế 2018

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện RNA đ c trưng c a virus Dengue trong huyết thanh ho c huyết tương người.

2. Nguyên lý

Xác định sự có m t c a gen đ c trưng sử dụng các c p mồi và probe cho virus Dengue bằng kỹ thuật Real-time RT- PCR

1. Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

2.2. Hóa chất, sinh phẩm và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

** Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

1. Lấy bệnh phẩm

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Tách chiết RNA tổng số

2.2. Thực hiện Real-time RT-PCR

Thực hiện bước này với các tube qPCR mix được giữ trong khay giữ lạnh ho c trên đá vảy.
Chỉ lấy đ số tube qPCR mix cần. Trước và sau khi đ t phản ứng qPCR phải spin down nhanh tube qPCR để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube
Chuẩn bị các thành phần c a phản ứng Real-time RT-PCR
Thêm 5 μl c a mẫu RNA, chứng dương ho c chứng âm vào từng tube qPCR đã gồm đầy đ các thành phần.
Kh i động máy real-time PCR. Kh i động máy tính và chương trình real- time PCR
Cài đ t vị trí mẫu trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy real- time PCR
Cài đ t chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Đọc kết quả bước sóng 530 (kênh màu FAM)

Các trường hợp	Chu kỳ (Ct)	Nhận định kết quả
1	Không tín hiệu	Dưới giới hạn phát hiện ho c âm tính
2	Tín hiệu xuất hiện < 38 chu kỳ	Dương tính
3	Tín hiệu xuất hiện trong khoảng 38-45 chu kỳ	Chạy lại, nếu vẫn 38-45c, kết quả là Dưới giới hạn phát hiện.

Đọc kỹ hướng dẫn qui trình xét nghiệm trước khi thực hiện.
Bảo quản bộ kit theo đúng hướng dẫn theo hướng dẫn c a nhà sản xuất, riêng thành phần mẫu chứng dương nên giữ -80o C cho bảo quản lâu dài.
Khu vực tách RNA, mix phản ứng qPCR phải được bố trí biệt lập và khử trùng b m t bằng dung dịch sodium hypochloride 0,5%, dụng cụ sau sử dụng phải rửa kỹ dưới vòi nước với xà phòng, sau đó lau lại bằng dung dịch RNase AWAYTM Decontamination Reagent; chiếu tia tử ngoại khi trước và sau khi thao tác để tránh nhiễm chéo.
Quá trình mix thực hiện trên đá vẩy ho c PCR cooler, thực hiện chạy Real- time-PCR ngay sau khi mix xong phản ứng.
Trong trường hợp mẫu chứng dương và mẫu chứng âm xuất hiện không đúng với diễn giải phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix, chứng dương và quá trình tách RNA tổng số, thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.