Sơ lược những phương pháp chẩn đoán huyết thanh - Phần 2

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp được sử dụng trong nhiều chẩn đoán vi khuẩn, và tiếp tục được sử dụng trong nhiều mục đích tương tự. Chất nền sử dụng thường là môi trường thạch hay môi trường lỏng, vi khuẩn có thể mọc trên tế bào chân hạt (eukaryotic cells)[như chlamydiae hay rickettsiae (50,51)] hoặc là tế bào kết hợp [đôi khi sử dụng huyết thanh học cho Bartonella henselae (52)]. Vi khuẩn có thể kết hợp hoặc không kết hợp với tế bào chân hạt, được gắn trên thủy tinh. Cơ chất được cho vào trong dãy huyết thanh pha loãng trong những giếng khác nhau trên lam kính, và kháng thể gắn huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng thể người (hình 3). Tín hiệu phải được đọc bằng kính hiển vi huỳnh quang có độ lọc thích hợp. Kháng thể phát hiện có thể là IgG hoặc IgM. Trong quá khứ, sự hằng định của fluorescein kết hợp cơ chất là có vấn đề, nhưng vấn đề này được làm giảm bớt một cách đáng kể. Hơn nữa để phát quang, có một số chất phát huỳnh quang khác có thể được sử dụng để gắn với kháng thể. Cả phương pháp cố định và bản chất của vi khuẩn phân lập có thể ảnh hưởng đến chất lượng phát huỳnh quang. Hầu hết những biến thiên quan trọng là do người quan sát, những người này phải có sự am hiểu về cường độ phát quang dù bất kể phương pháp tính điểm hay tiêu chuẩn sử dụng để xác định điểm cuối phát huỳnh quang (fluorescence end-point). Chỉ vì lý do này, hiệu giá của IFA có thể thay đổi theo những nơi thử khác nhau. Đánh giá tốt nhất là mang đến nơi có kinh nghiệm nhiều trong quan sát kính hiển vi huỳnh quang hơn là ở nơi mà không thường làm.

Do phát hiện IgM dễ dàng nên IFA được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, vì IFA có thể thực hiện xong trong vòng vài giờ. Hiệu giá IgM có ý nghĩa trong IFA có xu hướng tương đối thấp khi so sánh với hiệu giá IgG. Sự thay đổi IgG-IFA hơn bốn lần sẽ có ý nghĩa như là thử nghiệm CF . Nhiều thử nghiệm IgM-IFA đã có dạng thương mại và một số trong đó còn đang được tiếp tục sử dụng. Hầu hết những những thử nghiệm tốt là những phương pháp phát hiện IgM. Thử nghiệm IgM-IFA có thể nhạy nhưng không đặc hiệu với yếu tố thấp (rheumatoid factor).

Những thử nghiệm IFA qui ước như trên, sử dụng giá cứng và được quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi, nhưng thử nghiệm huỳnh quang pha cứng có thể cũng được đọc bằng máy đọc tự động. Điều này dựa trên hệ thống FIAX (53). Hơn nữa, dấu hiệu huỳnh quang có thể được sử dụng trong pha lỏng nhờ đó sự tương tác kháng nguyên-kháng thể được xảy ra trong pha lỏng tốt hơn là trong pha cứng.

Sử dụng dấu hiệu đồng vi phóng xạ được phát triển từ dấu hiệu huỳnh quang và những dấu hiệu khác, và phương pháp đo có khả năng tăng cường dấu hiệu phát hiện và độ nhạy. Nói chung, sử dụng miễn dịch phóng xạ trên pha cứng thì khá cũ trong chẩn đoán huyết thanh vi khuẩn và đã bị thay thế bởi EIA hơn 15 năm trước. Mặc dù đồng vị phóng xạ cho kết quả nhạy hơn so với những phương pháp khác, điều này có thể hứa hẹn mở ra một chương liên quan tới cơ sở dấu hiệu. Sự khó khăn trong việc đánh giá ‘signal-to-noise’ cũng là quan trọng trước tiên trong sự phát triển thử nghiệm có ích lợi, và biểu hiện ‘grey’ zones nhất thiết xảy ra. Sử dụng đồng vị phóng xạ và những tình hình đặc biệt liên quan là những yếu tố chống lại kỹ thuật này.

Sự kết tủa đồng vị phóng xạ (54) với kháng nguyên vi khuẩn có gắn phóng xạ chủ yếu phục vụ cho những nghiên cứu để biết rõ về đáp ứng miễn dịch thể dịch giống như immunoblotting hiện nay, nhưng có mặt như là kiểu chẩn đoán huyết thanh quan trọng mặc dù có khả năng được sử dụng như là thử nghiệm xác định.

Sự ra đời của thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng với kháng thể đánh dấu enzym (enzyme immunoassays; EIA) được chứng minh là một trong những tiến bộ quan trọng trong thời đại chẩn đoán huyết thanh, và nhiều thử nghiệm được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán vi sinh học cũng như trong nhiều chẩn đoán y khoa khác (không phải lĩnh vực vi sinh) (55-57). Những biến thể của EIA thì nhiều, nhưng thường được áp dụng nhất là EIA, EIA tóm bắt kháng thể (antibody-capture EIA), và antibody-capture double sandwich EIA (hình 4-6).

Nhiều loại enzyme được sử dụng cho thử nghiệm EIA, nhưng thường được sử dụng nhất là peroxidase và alkaline phosphatase. Bản chất của việc gắn kháng nguyên hoặc kháng thể với enzyme (mà không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym) là hoạt tính này gây biến đổi cơ chất enzyme, sự thay đổi màu cơ chất sẽ chỉ định lượng kháng thể hiện diện trong huyết thanh. Rõ ràng như hình trên, thử nghiệm EIA là đơn giản và thích được sử dụng trong hầu hết những thử nghiệm chẩn đoán huyết thanh. Thử nghiệm dạng này thì nhạy nên có thể cho kết quả dương tính giả khi kháng thể trong huyết thanh thử gắn trên giá cứng hay thành phần của kháng nguyên điều chế mà không thật sự gắn với kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn. Cũng như vậy, kiểu cạnh tranh trực tiếp, thử nghiệm EIA gián tiếp cũng cho kết quả dương tính giả do nồng độ cao của kháng thể thuộc giống trong huyết thanh kết hợp không đặc hiệu với giá cứng. Vì những lý do này, thử nghiệm tóm bắt kháng thể được tạo ra. Thử nghiệm này có thể sử dụng kháng nguyên đánh dấu để phát hiện hoặc phức hợp sandwich mà kháng thể đánh dấu được phát hiện.

Dù là gián tiếp hay tóm bắt kháng nguyên, EIA có thể sử dụng tìm kháng thể IgM hoặc IgG hay IgA; hơn nữa, phát hiện IgM là có giá trị vì có khả năng chẩn đoán chỉ với một bệnh phẩm huyết thanh. Thử nghiệm EIA dễ chuẩn hóa, tự động, quay vòng nhanh và có thể thử nhiều mẫu cùng lúc. Thử nghiệm có thể hoàn tất từ 3-5 giờ và một số phương pháp nhanh có thể rút ngắn thời gian từ 1⁄2 giờ đến 1 giờ.

Loại kháng nguyên sử dụng có thể thay đổi từ vi khuẩn nguyên thể đến sonicates hoặc những thành phần trích xuất tinh khiết hay tổng hợp (peptides tổng hợp hoặc tái tổ hợp). Những kháng nguyên đó có thể là proteins, lipids, carbohydrates, hoặc dạng kết hợp. Chúng được gắn thụ động hay chủ động trên giá cứng. Dung dịch đệm Alkaline carbonate (pH~9.0-9.5) làm gia tăng sự gắn kết của nhiều kháng nguyên trên những giá cứng thông thường. Chất dẻo và những biến thể của nó thường được sử dụng nhất làm giá cứng và hình thể của giếng thích hợp để rửa cho hầu hết những hệ thống. Sử dụng những hạt làm bề mặt kết hợp hoặc sử dụng những loại giá khác như thủy tinh, nitrocellulose và nylon cũng được quan tâm. Khi kháng nguyên được gắn vào giá cứng, có khả năng kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân cũng gắn vào giá cứng theo kiểu giống như vậy do đó những chỗ còn có thể kết hợp cần phải được ngăn chặn lại bằng một số chất. Những dung dịch thích hợp để ngăn chặn bao gồm dung dịch đệm với albumin, gelatin và sữa không kem. Có nhiều cố gắng trong việc tăng cường hoạt tính enzym bằng nhiều cơ chế (như khuếch đại dấu hiệu avidin-biotin), nhưng hầu hết những cải tiến đó chỉ thu được những lợi ích về độ nhạy và thường trả giá bằng những vấn đề khác mà thường là liên quan đến độ đặc hiệu. Tuy nhiên, chất lượng của conjugates được cải thiện rất lớn trong hơn 2 thập kỷ qua và kháng thể tinh chế cũng sẵn có. Sử dụng kháng thể đơn dòng hay là kháng thể đa dòng cũng đều có giá trị. Trong một số hệ thống, có thể không đánh dấu enzym; sự phát quang bằng phản ứng hóa học (chemiluminescence) tạo ra do sử dụng sự oxy hóa hợp chất tạo ra cuối cùng. Sử dụng hệ thống đọc tự động đã đơn giản hóa việc giải thích và đo lượng sản phẩm (reproducible).

Mặc dù thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng chuẩn bao gồm lớp kháng nguyên và kháng thể, có nhiều sản phẩm chẩn đoán huyết thanh dạng thương mại ra đời và cũng sử dụng nguyên tắc miễn dịch học nhưng thời gian thử nghiệm nhanh hơn với thử nghiệm đơn giản chỉ một bước thực hiện (a simple one-step membrane assay). Một số cách xét nghiệm nhanh được sử dụng trong thực tế như chẩn đoán huyết thanh Helicobacter pylori (58). Cả thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng và thử nghiệm nhanh (rapid membrane assay) đều có thể được sử dụng trong sàng lọc khi có số lượng lớn mẫu hoặc đơn giản chỉ do phương pháp là đơn giản.

IgM đặc hiệu cho bệnh xuất hiện sớm khoảng 5-7 này sau khi bệnh trong một số nhiễm khuẩn mặc dù thường là từ 7-10 ngày. Xác định IgG có thể làm ở huyết thanh giai đoạn cấp và huyết thanh giai đoạn lui bệnh, tuy nhiên yêu cầu sự thay đổi tối thiểu của EIA cho chẩn đoán dương tính có thể còn là chủ đề bàn cãi. Tiêu chuẩn Interpretive criteria thường bao gồm ‘grey zone’ của kết quả nghi ngờ dựa vào hoạt tính enzyme đo ở quang phổ liên tục (continuous spectrum). Chọn ngưỡng chẩn đoán đặc hiệu còn là vấn đề quan trọng trong thử nghiệm miễn dịch. Những thử nghiệm ngăn chặn (Blocking assays), sự có sự cạnh tranh kháng thể bởi sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng nguyên khác, có thể sử dụng cho mục đích xác định, dù nhiều phương pháp thường được sử dụng trong tình huống đảm bảo kết quả dương tính khi thử nghiệm miễn dịch trên pha cứng để phát hiện kháng nguyên. Kháng thể mong muốn cũng có thể được ước lượng bằng những thử nghiệm miễn dịch này, dù điều này không thực sự có nhiều giá trị cho chẩn đoán huyết thanh.

Bản chất của những thử nghiệm miễn dịch này làm tăng độ nhạy tối đa để có thể phát hiện được kháng thể từ nhiều tháng đến nhiều năm sau nhiễm khuẩn cấp, thậm chí cả IgM. IgM có thể khó hiểu nếu tác nhân quan tâm có khả năng nhiễm lại.

Yếu tố thấp có thể cản trở giải thích chính xác kết quả IgM. Sự dư thừa IgG đặc hiệu cũng cản trở việc xác định IgM. Đối với vấn đề này, sự cản trở có thể được loại trừ bởi huyết thanh thử được hấp phụ IgG trước khi thử IgM.

Dĩ nhiên là sử dụng pha cứng là dễ dàng cho sự tương tác kháng nguyên-kháng thể như chi tiết ở trên, tuy nhiên pha lỏng sẽ thích hợp cho nhiều thử nghiệm xác định (59). Cơ bản là, sự thay đổi hoạt tính enzyme hoặc sự phát huỳnh quang có thể làm tăng sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể thay đổi hoạt tính đánh dấu. Thử nghiệm có thể được chế ra dạng thử nghiệm một bước (one-step) và máy đọc tự động có thể sử dụng để chuẩn hóa việc định lượng. Từ khi phản ứng được làm trong pha lỏng, bản chất của kháng nguyên cho phép phức hợp miễn dịch còn lơ lửng và rồi dạng này có lợi do kháng nguyên nhỏ hơn, như là những thành phần vi khuẩn, enzymes hoặc độc tố vi khuẩn, hơn là vi khuẩn nguyên thể hoặc những phức hợp lớn. Chẳng hạn, một phương pháp bị ảnh hưởng bởi mức độ kháng sinh, như aminoglycosides. Thử nghiệm miễn dịch trong pha lỏng cũng được biết là thử nghiệm thuần nhất (homogeneous).

Thực chất, immunoblotting quy ước (thường nói đến là Western blotting) để chẩn đoán huyết thanh là khác với những biến thể của EIA trên pha cứng (60-62). Sự khác biệt lớn là hiệu giá những giếng ở EIA trên pha cứng thường được đo bằng quang phổ kế (colorimetric), gián tiếp cho biết hiện diện kháng thể, ngược lại phản ứng của kháng thể với kháng nguyên đặc hiệu có thể nhìn trong thử nghiệm immunoblot tách những kháng nguyên vi khuẩn ra (segregated bacterial antigens).

Hầu hết những kháng nguyên trong thử nghiệm immunoblotting được biểu hiện bằng những vạch khử sodium dodecyl sulphate polyacrylamide trên gel điện di (SDS-PAGE) (63). Chúng sắp xếp theo sự thay đổi trọng lượng phân tử từ cao nhất đến thấp nhất trên đường di chuyển. Dù một số kháng nguyên có thể xuất hiện có tỉ lệ di chuyển nhất định liên quan đến trọng lượng phân tử chẩn, thật ra chúng có thể có khác biệt trọng lượng phân tử do diều kiện điện di và cấu trúc của kháng nguyên. Kiểu phân giải của kháng nguyên được di chuyển trên giá cứng sẽ biểu hiện cho kháng thể trong huyết thanh và gắn enzym cho kháng thể phát hiện. Giá cứng có thể là nylon, nitrocellulose (thường nhất), và những dẫn xuất cellulose. Hầu hết những cấu trúc phân giải trong SDS-PAGE thường qui là toàn bộ hay từng phần polypeptides. Tuy nhiên, có thể kiểu phân giải của glycolipids sử dụng kỹ thuật khác và tiếp theo là immunoblotting, nhưng hiếm khi được khảo sát. Tuy nhiên phải thừa nhận rằng những kháng nguyên được nhận biết từ immunoblotting được chọn trước bởi quá trình mà đã chọn lựa sự phân giải và kích thước hoặc bản chất kháng nguyên có thể biểu hiện khác nhau.

Immunoblotting có thể thực hiện chọn lọc cho kháng thể IgM, IgG hoặc IgA bằng cách sử dụng conjugated thích hợp. Bản chất của thử nghiệm có khả năng đưa ra một phương pháp xác định huyết thanh học hơn những phương pháp khác sử dụng chất chỉ thị gián tiếp sự tương tác kháng nguyên-kháng thể. Điều này được minh họa tốt nhất bằng sử dụng immunoblotting trong bệnh Lyme (chương 25). Kiểu nhìn đáp ứng tương tự để chẩn đoán xác định có thể gồm 1 hay nhiều kháng nguyên. Có sự thay đổi đáng kể trong đáp ứng thể dịch với hầu hết vi khuẩn và nhiều tính không đồng nhất có thể thấy với immunoblotting ở đây nhiều phản ứng kháng nguyên được xác định một lần. Ngược lại có thể có một số kháng nguyên trội hơn thường được nhận biết, nhiều kháng nguyên khác có thể là chủ đề của sự nhận biết trái ngược nhau (the subject of inconsistent recognition). Hơn nữa, nhiều sự nhận biết là không tuyệt đối là âm tính hay dương tính khi những vạch chia độ dương tính có thể thấy đối với bất kỳ kháng nguyên đã nói (64). Thật vậy, những chi tiết của phương pháp có thể tạo ra ảnh hưởng lớn đến kết quả immunoblotting. Cũng vậy, có thể thấy một số thay đổi của từng đợt chạy trong mô hình đáp ứng kháng thể (it is possible to see some run-to-run variation in antibody response patterns). Một số kháng nguyên có thể thường gặp ở nhiều vi khuẩn và do đó phải được xem xét thận trọng như là chỉ thị cho chẩn đoán huyết thanh, như proteins roi của borreliae và treponemes (65). Mặc dù kháng nguyên trội hơn có thể thấy, sự đặc hiệu của mô hình phản ứng dường như lớn hơn nếu sử dụng hơn một kháng nguyên trong tiêu chuẩn đánh giá dương tính.

Trong những năm 1980, sự chuẩn hóa immunoblots là vấn đề rất khó khăn (66), nhưng đã có nhiều cải tiến trong lĩnh vực này, như là chế ra thử nghiệm immunoblots dạng thương mại cho kết quả đáng tin cậy. Sự giải thích tình huống immunoblot dương tính để chuẩn đoán cho tất cả các nơi trên thế giới phải được xem xét cẩn thận từ đó nó có thể đảm bảo rằng phản ứng kháng nguyên sẽ giống nhau khi cơ chất kháng nguyên thông thường được sử dụng. Thí dụ trong bệnh Lyme (xem chương 25), thấy rõ có một số khác biệt đáng kể về cấu trúc giữa chủng ở Bắc Mỹ và chủng ở Châu Âu.

Một khó khăn của immunoblotting, thậm chí khi chất nền (substrates) là dạng thương mại, đòi hỏi rằng phương pháp có thể sử dụng cho số lượng bệnh phẩm ít và thông thường cho mục đích xác định hơn là thử cho một lô nhiều bệnh phẩm.

Sự sản xuất polypeptide từ tế bào nguyên thể, có thể làm hư những proteins khác từ môi trường tăng trưởng, làm xuất hiện lợi ích lý thuyết tăng cơ hội kể cả những kháng nguyên không đặc hiệu. Về mặt này, hứa hẹn trong tương lai sẽ phát minh những kháng nguyên tinh chế và tái tổ hợp có thể giải quyết tình trạng trên (67).

Immunoblotting có thể là kỹ thuật rất nhạy so với phương pháp EIA. Vì tất cả kháng thể mất đi sau vài tháng nhiễm khuẩn, sự thay đổi trong mô hình immunoblot có thể khác nhau như là hoạt tính kém hơn những kháng nguyên thông thường không xuất hiện trước tiên (68).