Quy trình định lượng kháng thể kháng chuỗi nhân - chuỗi kép trong chẩn đoán bệnh tự miễn

Không chỉ riêng kháng thể kháng chuỗi nhân và chuỗi kép, việc xét nghiệm phát hiện và định lượng các kháng thể nói chung trong chẩn đoán bệnh tự miễn là có cùng nguyên lý.

Cụ thể là các xét nghiệm đều dựa trên một chuỗi những phản ứng miễn dịch nối tiếp nhau có sự kích hoạt bởi các enzyme bổ sung. Đầu tiên, một lượng hóa chất chứa kháng thể chống lại tự kháng thể sẽ cho vào ủ cùng với máu bệnh nhân. Trong trường hợp, bệnh phẩm thực sự có các tự kháng thể của những bệnh lý tự miễn, chúng sẽ gắn kết với các kháng thể trong hóa chất và tạo thành các phức hợp kết tủa. Bước tiếp theo là rửa đi các phân tử không gắn và gắn không đặc hiệu trong bệnh phẩm. Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme được bổ sung sẽ gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể đã được cố định với các chất huỳnh quang tạo màu. Màu sắc này chỉ được quan sát thấy dưới kính hiển vi quang học và có thể đo bằng phương pháp quang học ở bước sóng 650 nm. Khi độ màu càng cao sẽ càng tỉ lệ thuận với nồng độ của phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Từ đó, nồng độ kháng thể trong một đơn vị thể tích máu ban đầu sẽ được tính toán ra và ước lượng chung cả nồng độ kháng thể lưu hành trong máu toàn cơ thể người bệnh.

Như vậy, quy trình định lượng kháng thể kháng chuỗi nhân - chuỗi kép trong chẩn đoán bệnh tự miễn cần phải trải qua nhiều giai đoạn, trước đây cần làm thủ công hoàn toàn nhưng ngày nay đã có phương tiện máy móc hỗ trợ một phần. Từ đó, kết quả ghi nhận được sẽ chuẩn xác hơn.

2.1. Nhân lực

Vì đây là một xét nghiệm chuyên sâu, có tính tinh vi cao; đồng thời, kết quả của xét nghiệm còn mang tính quyết định chẩn đoán và điều trị cho người bệnh, quy trình xét nghiệm định lượng kháng thể kháng chuỗi nhân - chuỗi kép đòi hỏi cần có bác sĩ chuyên ngành xét nghiệm hóa sinh thực hiện.

Trong trường hợp khác, có thể thay thế bằng kỹ thuật viên phòng xét nghiệm chuyên nghiệp, giàu kinh nghiệm và đã được đào tạo về xét nghiệm các tự kháng thể trong chẩn đoán các bệnh lý miễn dịch nói riêng và các xét nghiệm có nguyên lý gắn huỳnh quang nói chung.

2.2. Phương tiện, hóa chất

Máy xét nghiệm sinh hóa miễn dịch có thực hiện các xét nghiệm có nguyên lý gắn huỳnh quang. Bộ hóa chất xét nghiệm phát hiện ANA: gồm 8 giếng chứa các thành phần sau:

• Giếng 1 và 2: Giếng trống, dùng để pha loãng mẫu.
• Giếng 3 và 4: Giếng phản ứng, dùng để phủ kháng nguyên với bệnh phẩm, nhằm tạo ra phức hợp kháng nguyên - kháng thể nếu có tự kháng thể.
• Giếng 5: Giếng chứng, màu vàng, chứa kháng thể đặc hiệu, PBS, BSA (Albumin huyết thanh bò), chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% và proclin 300 0,05%.
• Giếng 6: Giếng chứa chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt, chứa kháng thể kháng igg người gắn HRP; PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản proclin 300 0,05%.
• Giếng 7: Giếng chứa dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% và proclin 300 0,05%.
• Giếng 8: Giếng chứa cơ chất TMB, trong suốt, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin và kháng thể ANA phủ sẵn trong các vi giếng với tên mã hóa sản phẩm là ANAscreen

Bộ hóa chất xét nghiệm phát hiện anti-dsDNA: gồm 8 giếng chứa các thành phần sau:

• Giếng 1 và 2: Giếng trống, dùng để pha loãng mẫu
• Giếng 3 và 4: Giếng phản ứng, dùng để phủ kháng nguyên với bệnh phẩm, nhằm tạo ra phức hợp kháng nguyên - kháng thể nếu có tự kháng thể.
• Giếng 5: Giếng chứng, màu vàng, chứa kháng thể đặc hiệu, PBS, BSA (Albumin huyết thanh bò), chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% và proclin 300 0,05%.
• Giếng 6: Giếng chứa chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt, chứa kháng thể kháng igg người gắn HRP; PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản proclin 300 0,05%.
• Giếng 7: Giếng chứa dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% và proclin 300 0,05%.
• Giếng 8: Giếng chứa cơ chất TMB, trong suốt, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin và kháng thể dsDNA là sợi kép tái tổ hợp (dsDNA người) phủ sẵn trong các vi giếng với tên mã hóa sản phẩm là dsDNA Screen.

Các dung dịch dùng cho hệ thống:

• Wash (1x20ml): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x).
• System fluid (1x2,5ml): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x).

Dụng cụ khác:

• Máy Vortex.
• Pipet 10 μl.
• Ống đong định lượng thể tích 1000 ml và 2500 ml.
• Nước cất hoặc nước khử ion.

Toàn bộ các dụng cụ xét nghiệm và hóa chất cần được bảo quản trong bóng tối ở điều kiện 2 - 8 độ C. Không để tiếp xúc với trực tiếp với nhiệt, ánh sáng mặt trời hoặc ánh sáng mạnh trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng.

2.3. Người bệnh

Đây là xét nghiệm như các xét nghiệm máu thông thường. Bệnh phẩm đem đi phân tích là máu lấy ở tĩnh mạch trên cẳng tay hay cánh tay. Người bệnh sẽ không ăn gì trước khi thực hiện lấy máu xét nghiệm.

Việc lấy máu sẽ do điều dưỡng hay kỹ thuật viên phòng xét nghiệm tiến hành sau khi đã giải thích cho gia đình và người bệnh hiểu rõ về ý nghĩa và quy trình xét nghiệm.

2.4. Giấy chỉ định

Khi bác sĩ cho chỉ định xét nghiệm, giấy chỉ định cần ghi đầy đủ và rõ ràng các thông tin của bệnh nhân và cụ thể mục tiêu xét nghiệm là định lượng kháng thể kháng nhân (ANA) hay kháng thể kháng chuỗi đôi (anti-dsDNA).

Về phía phòng xét nghiệm, các thông tin về thời điểm lấy mẫu, cách thức bảo quản mẫu và thời điểm dự kiến trả kết quả cũng cần được ghi nhận.

3.1. Lấy bệnh phẩm

Bệnh nhân được lấy máu tĩnh mạch ở cẳng tay hay cánh tay để làm bệnh phẩm xét nghiệm.

Mẫu máu cần được lưu trữ trong ống xét nghiệm và có chứa chất bảo quản đúng tiêu chuẩn, sau đó cần nhanh chóng gửi đến phòng xét nghiệm.

3.2. Tiến hành kỹ thuật

Máy xét nghiệm, hóa chất đã được khởi động chuẩn trước và sẵn sàng sử dụng.

Thực hiện chuẩn xét nghiệm Anti-ANA ổn định trong vòng 28 ngày và cần thực hiện hiệu chuẩn mỗi khi thay đổi lô hóa chất.

Kiểm tra chất lượng nằm trong giới hạn cho phép. Thông thường chạy nội kiểm hai mức mỗi ngày là mức bình thường và không bình thường. Đối chiếu với luật về kiểm tra chất lượng nếu đạt thì tiến hành phân tích mẫu .

Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo quy trình của máy. Khi có kết quả, bác sĩ hay kỹ thuật viên sẽ phân tích và đối chiếu với phiếu xét nghiệm, in và trả kết quả cho người bệnh đúng thời gian đã hẹn.

Phần bệnh phẩm còn dư và chất thải từ máy xét nghiệm được xử lý như rác thải y tế lây nhiễm trước khi thải ra môi trường.

4.1. Giá trị tham chiếu của định lượng kháng thể kháng nhân (ANA)

• Bình thường: kết quả âm tính, giá trị định lượng dưới 1,0 U/ml
• Kết quả nghi ngờ: giá trị định lượng từ 1,0 đến 1,2 U/ml
• Kết quả dương tính: giá trị định lượng trên 1,2 U/ml

4.2. Giá trị tham chiếu của định lượng kháng thể kháng chuỗi kép (anti-dsDNA)

• Bình thường: kết quả âm tính, giá trị định lượng từ dưới 25 U/ml
• Kết quả dương tính: giá trị định lượng trên 25 U/ml

Các phạm vi tham chiếu giới hạn bệnh lý và giới hạn bình thường là tùy vào loại kháng thể cần định lượng và tùy vào phòng xét nghiệm với hệ thống máy móc, dụng cụ, hóa chất cũng như quy trình chuẩn hóa đang sẵn có.

Với các phương tiện máy móc, dụng cụ, hóa chất cũng như quy trình chuẩn hóa đang sẵn có, cho đến nay, hầu hết các phòng xét nghiệm đều chưa báo cáo về các yếu tố có thể gây sai lệch kết quả định lượng kháng thể kháng chuỗi nhân - chuỗi kép.

Thậm chí, kết quả không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nếu mẫu bệnh phẩm bị tán huyết, có nồng độ cao triglyceride hay bilirubin một cách bất thường. Đồng thời, việc bảo quản máu với chất chống đông Citrate, EDTA hay Heparine đều không gây sai lệch kết quả phát hiện và đo lường nồng độ ANA và anti-dsDNA.

Khi phát hiện người bệnh có các dấu hiệu nghi ngờ, việc phát hiện và đo lường nồng độ kháng thể kháng nhân (ANA) và kháng thể kháng chuỗi kép (anti-dsDNA) là một bước quan trọng trong quá trình chẩn đoán bệnh tự miễn. Theo đó, khi xác chẩn càng sớm, người bệnh càng được tích cực điều trị từ đầu sẽ hạn chế các tổn thương do hệ miễn dịch gây và tiên lượng bệnh lâu dài.