Kỹ thuật không cấy để chẩn đoán nhiễm trùng trong phòng xét nghiệm - Phần 2

Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ có thể dùng đo nồng độ kháng nguyên: Sự liên kết của kháng nguyên đánh dấu phóng xạ từ một tới một giới hạn nhưng số lượng chuẩn của kháng thể có thể bị từng phần ngăn cản bởi sự thêm vào kháng nguyên không đánh dấu. Tỉ lệ của kháng nguyên tự do với giới hạn kháng thể có thể được dùng để đo chất không đánh dấu đã được thêm vào. Trong thực hành, nó thường đạt được bởi liên kết với kháng thể từ bề mặt miếng nhựa làm tiện lợi tách rời của giới hạn từ kháng nguyên tự do.

Trong sự biến đổi khác, kháng nguyên thử nghiệm không đánh dấu là thêm vào từ kháng thể giai đoạn đồng nhất và tỷ lệ phần trăm chiếm giữ vị trí kháng thể, mà nó cân đối với nồng độ kháng nguyên được phát hiện bởi sự thêm vào kháng thể đánh dấu thứ hai. Đây là một khuynh hướng mà bây giờ tìm cách thay thế đồng vị phóng xạ với:

• Đánh dấu enzym: như kỹ thuật miễn dịch men ELISA (Enzym link immunosorbent assay) chất đánh dấu trong phản ứng này là một loại enzym, enzym này phản ứng với cơ chất sẽ sinh màu. Kết quả phản ứng được quan sát bằng mắt thường hoặc được đọc bằng máy quang phổ kế.
• Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: Là phương pháp có độ nhạy rất cao.

Kháng thể đơn dòng có thể phân biệt giữa loài và dòng của cùng loài dựa trên cơ bản sự khác nhau của kháng nguyên: Nguyên tắc của kỹ thuật kháng thể đơn dòng là làm bất tử hóa các tế bào lympho sản xuất kháng thể, rồi sau đó tách biệt từng dòng tế bào lympho bằng kỹ thuật đồng hóa. Kháng thể đơn dòng có công dụng rất lớn ngày càng được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật miễn dịch đòi hỏi độ nhạy và độ đặc hiệu cao như dùng chẩn đoán Rotaviruses, HIV, viêm gan siêu vi B, herpes và virus hợp bào đường hô hấp (RSV) có thể tất cả được phát hiện trực tiếp với kháng thể đơn dòng bằng ELISA. Nhiễm trùng Chlamydia trachomatis có thể chẩn đoán với vài giờ bởi thử nghiệm kháng thể gắn huỳnh quang trực tiếp tận dụng một kháng thể đơn dòng được đánh dấu với huỳnh quang.

Vi khuẩn mang gene có yếu tố độc lực có thể phát hiện bằng thăm dò acide nucleic biết yếu tố độc lực. Thăm dò một gene là một phân tử acide nucleic đặc hiệu ở dạng sợi đơn đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hay enzyme. Quá trình lai xảy ra: DNA probe sẽ tìm đoạn DNA tương ứng của nó trong bệnh phẩm để kết hợp lại tạo nên sợi kép. Có DNA lai tức là có vi khuẩn gây bệnh trong bệnh phẩm. Thăm dò cấu trúc của yếu tố độc lực như độc tố, những vi khuẩn mang gene đó có thể được phát hiện trong mẫu bệnh phẩm mà không cần phải cấy. Thí dụ: Thăm dò độc tố đường ruột của Escherichia coli hoặc độc tố tả có thể phát hiện trực tiếp trong phân .DNA probe có đánh dấu I125 bán sẵn trên thị trường trực tiếp tiếp xúc mảnh đặc hiệu, RNA ribosomal của Mycoplasma pneumoniae đã được dùng thành công để phát hiện vi khuẩn trong bệnh phẩm đàm.

Thăm dò acide nucleic được giới hạn sử dụng cho một số lượng nhỏ vi khuẩn: Nó không còn nghi ngờ rằng gene probes sẽ phát triển tăng lên cho mục đích chẩn đoán, nhưng nó cũng phát hiện được khi có số lượng nhỏ vi khuẩn (Thí dụ: vài bản sao của gene) có thể bị một yếu tố hạn chế và trong trường hợp đó khuyếch đại gene bởi kỹ thuật PCR bằng sự lai với oligonucleotide probes có thể trở thành phương pháp được lựa chọn, đặc biệt để cho vi khuẩn mọc chậm và khó tăng trưởng trong phòng thí nghiệm.

PCR có thể dùng lại một đoạn DNA đặc hiệu để tạo ra hàng tỷ bản sao chỉ trong vòng vài giờ: Mặc dầu về mặt lý thuyết, PCR có thể phát hiện một đoạn gene đơn chẳng hạn tính nhạy cảm là hiếm đạt được trong mẫu bệnh phẩm trên lâm sàng. Nhưng vi khuẩn hiện diện với số lượng giữa 10-100 có thể được phát hiện bởi kỹ thuật PCR chuẩn và phương pháp tinh vi hơn mà nó có thể phát hiện tiền virus HIV đoạn DNA trong 106 tế bào. Thuận lợi hơn nữa là sự mau lẹ mà nó vẫn đạt được kết quả. Sự khuếch đại chỉ mất khoảng 5 giờ, mặc dầu sự xác nhận của tính hiện diện sản phẩm bằng thăm dò hoặc đang diễn tiến có thể hơn 36 giờ, qua đó chỉ nên nhanh lên với kỹ thuật micro-array.

Tính đặc hiệu của PCR là được xác định bởi chọn lựa cẩn thận những mồi: Những mồi này (oligonucleotides) là hoàn chỉnh từ DNA đích, vì vậy trong sự sắp xếp phải phù hợp mồi, thứ tự của DNA đích phải được biết. Ở thời điểm bây giờ đây là một hạn chế của PCR nhưng kỹ thuật này nhiều công dụng sẽ chắc chắn được phát triển để ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng. Hiện tại nó chỉ được dùng trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm nhưng nó dường như là một vấn đề về thời gian trước khi phương pháp này có thể được dùng trong chẩn đoán thường quy. Vừa rồi PCR đã có ứng dụng vào bệnh phẩm khác nhau như dịch não tuỷ, nước tiểu, đàm, máu, sinh thiết... đến chẩn đoán nhiễm trùng nguyên nhân là vi khuẩn, virus, nấm và nguyên sinh động vật.

Vi khuẩn và nấm có thể được cấy trên môi trường dinh dưỡng đặc hoặc môi trường lỏng. Vi khuẩn và nấm tăng trưởng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng đặc từ đó mọc những khúm gồm hàng ngàn tế bào phát sinh từ một tế bào đơn được cấy trên bề mặt thạch. Những khúm của những loài khác nhau thường có vẻ ngoài đặc trưng mà có thể đưa ra chứng cứ từ hiện diện giống nhau của nó. Nó mất 12-48 giờ để cho những khúm của hầu hết các loài trở nên lớn có thể xem bằng mắt thường nhưng một vài vi khuẩn nhân nhiều, chậm hơn và có thể mất vài tuần để tạo ra khúm có thể xem bằng mắt thường. Cấy cũng có thể được làm trên môi trường lỏng và phát hiện sự tăng trưởng bằng quan sát độ đục của môi trường

Tuy nhiên, nó không thể nói cho biết có thể có nhiều hơn một loài hiện diện trong dịch cấy và cũng không biết có bao nhiêu vi khuẩn. Môi trường đặc có nhiều hữu dụng trong chẩn đoán vi khuẩn.

Nó có thể phần lớn các loài của vi khuẩn và nấm quan trọng trong y khoa tăng trưởng trên môi trường nhân tạo trong phòng thí nghiệm, nhưng không có một môi trường cấy chung nào sẽ chứng minh sự tăng trưởng của tất cả chúng. Vẫn có vài loài chỉ có thể tăng trưởng trong động vật thí nghiệm, thí dụ: Mycobacterium leprae và Treponema pallidum. Một vài vi khuẩn có thể được cấy trên môi trường nhân tạo, thí dụ: chlamydia và rickettsia có thể tăng trưởng trên tế bào cấy.

Có nhiều môi trường cấy điều chế không chỉ để chứng minh sự tăng trưởng của vi khuẩn nhưng cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn khác, thí dụ môi trường chọn lọc. Môi trường quan trọng dùng trong chẩn đoán phòng thí nghiệm và kế hoạch dùng môi trường này để tiến hành phân biệt các mẫu thử lâm sàng.

Bệnh phẩm được chọn lựa từ các vị trí trên cơ thể có vài vi khuẩn thường trú sẽ trộn lẫn với vi khuẩn gây bệnh đã được ghi nhận. Bệnh phẩm phải được lấy một cách cẩn thận, chọn lựa chất dinh dưỡng và chọn lựa môi trường để tạo ra những khúm riêng lẻ. Đây là cấy phụ từ môi trường sạch để định danh và thử độ nhạy cảm của kháng sinh. Nó phải mất ít nhất 48 giờ và thỉnh thoảng dài hơn để mang lại kết quả.

Vật ký sinh như là Leishmania, Trypanosoma và Trichomonas có thể cấy trong môi trường lỏng cho phép hiện diện một số lượng nhỏ trong bệnh phẩm ban đầu thí dụ: Máu và dịch tiết âm đạo để nhân đôi và như thế nó trở nên dễ dàng phát hiện bằng kính hiển vi. Ký sinh trùng không có hình thành khúm trên môi trường đặc trong cùng một cách như vi khuẩn và nấm.

Bởi vì vi khuẩn này không có khả năng tồn tại trong môi trường tự do. Hầu hết tế bào sống dùng trong chẩn đoán phòng thí nghiệm là tế bào tiếp tục line-human hoặc tế bào động vật làm cho thích nghi để tăng trưởng in vitro có thể tồn trữ -80oc đến khi yêu cầu. Bệnh phẩm được giới thiệu trong môi trường cấy tế bào và hiện diện của virus được phát hiện bằng quan sát những tế bào cho tác động bệnh học tế bào (CPE).

Kỹ thuật cấy tế bào là chuyên biệt và đòi hỏi nhiều nỗ lực và vài virus không gây ra CPE, thí dụ: rubella hoặc gây ra CPE mất 1 tuần hoặc hơn để tiến triển tuần tự thí dụ: cytomegalovirus (CMV); Mặc dù kháng nguyên CMV có thể phát hiện sau 1-2 ngày trong tế bào. Vì thế phương pháp khác như phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể được sử dụng để chẩn đoán nhiễm trùng virus bất cứ nơi nào có thể