Kỹ thuật không cấy để chẩn đoán nhiễm trùng trong phòng xét nghiệm - Phần 1

Kỹ thuật cấy là tập trung cao và thời gian trả kết quả chậm bởi vì sự nhân lên của vi khuẩn là yếu tố cần thiết nhưng bị hạn chế về đánh giá và biện pháp thực hiện vì nó phụ thuộc vào vi khuẩn có phân lập được hay không.

Trong điều kiện cần phải có, vài vi khuẩn có thể được cấy trong môi trường nhân tạo và vi khuẩn sống có thể cần những nhu cầu khác nhau để mọc được từ bệnh phẩm của bệnh nhân và bệnh phẩm của những bệnh nhân đang được điều trị kháng sinh. Kỹ thuật không cấy không yêu cầu nhân lên của vi khuẩn trước khi được phát hiện. Vài kỹ thuật, chẳng hạn như dùng kính hiển vi và sự phát hiện kháng nguyên của vi khuẩn trong mẫu tiêu bản. Nó có thể cung cấp kết quả nhanh chóng, thí dụ như với sau 2 giờ. Phương pháp không cấy khác như là thăm dò DNA và sự ứng dụng của DNA bởi phản ứng khuếch đại chuỗi PCR.

2.1 Kính hiển vi

Kính hiển vi là một bước quan trọng đầu tiên trong xét nghiệm tất cả các mẫu bệnh phẩm. Sử dụng kính hiển vi có vai trò chủ yếu trong vi khuẩn học. Bởi vì vi khuẩn có độ dao động lớn về kích thước, quá nhỏ để có thể nhìn thấy được bằng mắt thường, bởi vậy một kính hiển vi (KHV) là dụng cụ cần thiết trong vi khuẩn học. Kính hiển vi thường sử dụng ánh sáng thấy được như một nguồn sáng, ta có thể quan sát được mẫu vật rất nhỏ cũng như vài chi tiết cấu trúc của nó. Có thể tính được độ phóng đại toàn phần của một mẫu vật bằng cách nhân độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính. Một nguyên tắc tính chung cho các kính hiển vi là bước sóng của ánh sáng sử dụng càng ngắn thì độ phân giải càng cao. Ánh sáng trắng sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang có bước sóng khá dài và do đó ta không thể thấy được cấu trúc nhỏ hơn 0.2 μm. Kính hiển vi điện tử có thể cải tiến điều này tới khoảng 0.001 mm.

Kính hiển vi với ánh sáng thường được sử dụng để xem xét mẫu bệnh phẩm trực tiếp và sau cấy như soi tươi và nhuộm tiêu bản. Bệnh phẩm soi tươi thường sử dụng để tìm:

• Tế bào máu (HC) và tìm vi khuẩn trong bệnh phẩm là dịch như nước tiểu, phân hoặc dịch não tủy (CSF).
• Bào nang, trứng và ký sinh trùng trong phân.
• Nấm ở da
• Động vật nguyên sinh trong máu và mô.

Đối với vi khuẩn sống có thể quan sát sự di động của chúng.

2.2 Nhuộm

Nhuộm thường là nhuộm màu tế bào vì thế có thể nhìn dễ dàng hơn, nhuộm thường làm khô vật liệu đó bằng nhiệt hoặc alcohol được gắn trên tấm kính để xem trên kính hiển vi. Tiêu bản từ mẫu thử bệnh phẩm hoặc được làm thuần nhất bằng cách cấy sau đó vi khuẩn được nhuộm màu. Bình thường tia sáng sẽ đi qua một môi trường đơn, sau nhuộm ánh sáng sẽ xuyên qua hai vật chất của mẫu vật và của môi trường có độ chiết xuất khác nhau, do đó các tia sáng sẽ thay đổi hướng đi (khúc xạ) tại đường biên của mẫu vật và làm tăng độ tương phản giữa mẫu vật và môi trường. Khi các tia sáng đi ra khỏi mẫu vật, chúng sẽ tỏa ra tới các điểm phân giải rất gần nhau trên hình ảnh, các tia sáng này sẽ đi vào vật kính và hình ảnh sẽ được phóng đại lên. Tiêu bản này có thể được cất giữ lại sau đó quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng thường với vật kính dầu, dầu là để bảo tồn hướng đi của các tia sáng ở độ phóng đại cao nhất. Dầu sẽ có độ chiết xuất giống lame kính như vậy giọt dầu sẽ trở thành một bộ phận quang học của kính hiển vi.

2.3 Nhuộm Gram

Tính khác nhau quan trọng nhất của kỹ thuật nhuộm trong vi khuẩn là nhuộm gram: Nhuộm màu khác nhau tạo ra kỳ tích thật sự đó là tế bào với đặc tính nhuộm màu khác nhau và dựa trên phản ứng của nó để nhuộm gram vi khuẩn và chia làm hai nhóm chính:

• Gram dương (nhuộm vi khuẩn bắt màu tím)
• Gram âm (nhuộm vi khuẩn bắt màu hồng)

Tính khác nhau này là liên hệ tới sự khác nhau trong cấu trúc của vách tế bào của vi khuẩn hai nhóm.

2.4 Nhuộm Ziehl-Neelsen

Nhuộm Ziehl-Neelsen dùng để phát hiện vi khuẩn lao: Vài vi khuẩn và vi khuẩn có vách tế bào là chất sáp không thể nhuộm như nhuộm gram được mà phải nhuộm bằng phương pháp đặc biệt để phát hiện sự hiện diện của nó. Nhuộm Ziehl-Neelsen là phương pháp nhuộm dùng sức nóng gắn fuchsin vào trong tế bào sau đó tẩy màu ; nhuộm vi khuẩn lao với fuchsin chống lại sự làm bay màu với acide và alcohol. Ngoài ra còn nhuộm huỳnh quang bằng thuốc auramine mà có tính ưa mạnh đối với chất sáp ở thành tế bào của vi khuẩn lao, có thể quan sát vi khuẩn đó dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Kỹ thuật nhuộm khác có thể sử dụng phát hiện nét đặc trưng riêng biệt của tế bào là nhuộm đơn. Phương pháp này hay được dùng để nhuộm khảo sát có sự hiện diện của vi khuẩn Corynebacteria hay không vì phương pháp này nhuộm vi khuẩn và các hạt biến sắc có trong vi khuẩn. Tính đặc trưng để giúp đỡ nhận diện bao gồm polyphosphate tồn trữ trong hạt của Corynebacterium spp và lipid trong Bacillus spp

2.5 Kính hiển vi nền đen

Dùng để quan sát di động và những tế bào mảnh như Spirochetes: Kính hiển vi thường có thể được đặt vào bởi làm thay đổi hệ thống kính tụ quang vì thế xuất hiện ánh sáng chói chống lại nền đen. Vi khuẩn sống có thể xem xét bởi kính hiển vi nền đen và có thể quan sát được di động. Phương pháp này cũng được dùng để xem tế bào rất mỏng như Spirochetes bởi vì ánh sáng phản hồi từ bề mặt của tế bào làm cho nó xuất hiện lớn và vì thế dễ quan sát hơn khi xem xét bởi kính hiển vi thường.

2.6 Kính hiển vi với pha tương phản

Kính hiển vi với pha tương phản làm tăng độ tương phản của hình ảnh một vật:

Kỹ thuật này cải tiến thêm khác nhau rất nhỏ trong chỉ số khúc xạ và độ đậm đặc giữa tế bào sống và dung dịch của chúng là huyền dịch vì thế nó tạo ra hình ảnh của một vật với mức độ cao hơn của độ tương phản hơn đạt được bởi kính hiển vi vùng sáng. Tuy nhiên, kính hiển vi pha tương phản thì bây giờ hiếm dùng trong chẩn đoán phòng xét nghiệm.

2.7 Kính hiển vi huỳnh quang

Nếu ánh sáng của bước sóng chiếu sáng trên vật thể phát huỳnh quang, nó phát ra ánh sáng ở bước sóng khác nhau. Vài vật chất sinh vật học tự nhiên phát huỳnh quang ; Số khác có thể nhuộm với thuốc huỳnh quang và quan sát trên kính hiển vi với nguồn ánh sáng tử ngoại mặc dù của ánh sáng trắng.

Kính hiển vi huỳnh quang được dùng rộng rãi trong vi khuẩn học và miễn dịch học, đã được phát triển để phát hiện kháng nguyên của vi khuẩn trong mẫu thử và mô bằng cách nhuộm với kháng thể đặc hiệu gắn vào với thuốc nhuộm (miễn dịch huỳnh quang). Phương pháp này có thể được làm nhạy cảm nhiều hơn hoặc có thể gắn vào để phát hiện kháng thể bằng đồng vị đánh dấu một kháng thể thứ hai trong thử nghiệm trực tiếp.

2.8 Kính hiển vi điện tử

Mẫu thử cần phải được cắt thành lát mỏng ; Kính hiển vi điện tử dùng một tia điện tử thay vì những thấu kính dùng trong kính hiển ánh sáng thường. Hệ thống an toàn vì nó hoạt động dưới môi trường chân không cao. Tia điện tử lọt vào ít và tế bào vi khuẩn đơn thì quá dày để quan sát trực tiếp. Làm cho yếu này của mẫu thử thì cố định và đóng khung trên nhựa và cắt phần mỏng để xem xét từng cá thể. Eclectron-dense stains như osmium tetroxide, uranyl acetate hoặc glutaraldehyde cho các mẫu xét nghiệm để cải tiến độ tương phản. Tia điện tử xuyên qua mặt cắt và tạo ra hình ảnh của một vật trên màng huỳnh quang. Hình ảnh của một vật là chụp ảnh và phóng to vì thế từ bệnh phẩm gốc được phóng đại 1000.

Kính hiển vi điện tử có thể được dùng nhận diện phân tử virus: Xem trực tiếp mẫu bệnh phẩm cho phép nhận diện nhanh chóng những phân tử virus và phát hiện virus mà không thể cấy như Rotaviruses, Hepatis A virus. Dịch để xem phải được hong khô trên hệ thống ống đồng và quan sát. Khoảng một tỷ phân tử virus trong một ml là cần thiết nếu chúng có thể phát hiện. Tính nhạy cảm có thể tăng bởi đang phản ứng của dịch với kháng thể kháng virus vì thế các phân tử virus cụm lại thành chùm có thể nhìn được. Nó được biết như kính hiển vi miễn dịch điện tử là một kỹ thuật giống nhau từ miễn dịch huỳnh quang trên kính hiển vi thường.

2.9 Phát hiện kháng nguyên vi khuẩn trong bệnh phẩm

Phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn có thể là một phương pháp nhanh hơn để phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn từ sự tăng trưởng và nhận diện của vi khuẩn.

Phương pháp bao gồm:

• Phát hiện kháng nguyên bởi sự tương tác của nó với kháng thể đặc hiệu
• Phát hiện độc tố vi khuẩn.

Kháng thể đặc hiệu phủ lên phân tử latex sẽ phản ứng với vi khuẩn hoặc sản phẩm của nó, kết quả nhìn thấy kết cụm. Thí dụ: Tác nhân gây ra phổ biến của viêm màng não do vi khuẩn là Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae và Neisseria meningitidis type A và C có thể phát hiện trong dịch não tủy bởi trộn lẫn bệnh phẩm với kháng thể đặc hiệu bao bọc phân tử latex. Nếu kháng nguyên như vi khuẩn hoặc do sản phẩm được tạo ra và sự có mặt những phần tử đặc hiệu sẽ cụm lại cùng nhau. Thử nghiệm này cho ra kết quả chỉ vài phút từ khi nhận bệnh phẩm, nhưng tính nhạy cảm của nó không quan trọng hơn nhuộm gram và dương tính yếu có thể xảy ra do kháng nguyên có phản ứng chéo. Tuy nhiên, nó có thể được dùng hỗ trợ chẩn đoán khi bệnh nhân có điều trị bằng kháng sinh và vi khuẩn có thể xuất hiện không điển hình như trong dịch não tủy và mọc yếu trong canh cấy.