NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR - Bộ y tế 2018

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

• Xác định DNA đặcc trưng c a NTM (Nontuberculous mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm c a người.

2. Nguyên lý

• Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
•  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

•  Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.
•  Bộ lưu điện
•  Máy nhiệt
•  Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
•  Máy ly tâm lạnh
•  T lạnh 20C -80C
•  T âm sâu (-200 C) ho c (-700C) (nếu có)
•  Máy vortex
•  T an toàn sinh học
•  Micropipettes các thể tích từ 5 l - 1000 l.
•  Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 l - 1000 l.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

•  Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

• Đờm, các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não t y, nước tiểu, phân...), mảnh sinh thiết...

4. Phiếu xét nghiệm

• Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

• Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

Các bộ sinh phẩm (VD ho c tương đương):

•  ExiPrepTM Dx Mycobacteria Genomic DNA Kit (Bioneer).
•  Accupower MTB & NTM Real-time PCR Kit (Bioneer)

2.1. Thu nhận và xử lí mẫu

• Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).

2.2. Tách chiết DNA, RNA

2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh

•  Cài đ t chương trình cho máy real-time PCR trước khi pha hóa chất.
•  Chuẩn bị Master Mix
•  Cho chứng +, chứng - ho c dịch DNA tách chiết vào từng tube Master Mix.
•  Cài đ t vị trí mẫu trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy real-time PCR.
•  Chọn các kênh màu phù hợp với từng tác nhân c a mẫu, chứng dương và chứng âm.
•  Lưu file dữ liệu vào máy tính
•  Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

•  Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu n n và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính ho c thẳng và không vượt qua tín hiệu n n (đường biểu diễn âm tính).
•  Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính

2. Phân tích mẫu

•  Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu FAM và máy báo DETECTED.
•  Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính và và máy báo NON-DETECTED

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn g p sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.