I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

• Là quy trình phát hiện Mycobacterium tuberculosis complex từ ADN tách chiết c a mẫu đờm c a Người bệnh có triệu chứng nghi lao.

2. Nguyên lý

- Quy trình dựa trên phản ứng nhân gen đẳng nhiệt, LAMP ( loop- mediated Isothermal Amplication).

- Phương pháp LAMP có các đ c tính sau:

•  Chỉ 1 loại enzyme được sử dụng và phản ứng trong đi u kiện đẳng nhiệt
•  Độ đ c hiệu rất cao do b i sử dụng 4 đoạn mồi nhận biết 6 vùng riêng biệt trên trình tự đích
•  Hiệu quả khuếch đại cao cho phép thời gian khuếch đại ngắn
•  Quy trình tạo ra 1 số lượng lớn sản phẩm nhân gen cho phép phát hiện bằng mắt thường

- Các đoạn mồi được thiết kế dựa trên trình tự vùng gyrB và IS c a vi khuẩn lao.

- Việc phát hiện ADN khuếch đại dựa trên độ đục c a phản ứng và được quan sát dưới ánh sáng UV.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện:

•  Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ xét nghiệm .
•  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

• Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây ho c tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- T an toàn sinh học cấp I (nếu có)

- Pipét chuyên dụng c a Loopamp

- Máy vortex

• Máy trộn mẫu chuyên dụng c a Loopamp
• Máy PCR chuyên dụng c a Loopamp (LF160)

- Tủ lạnh 2-8 0C

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

*Ghi chú:

• Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

• Là mẫu đờm nhày m , không lẫn máu, c n thức ăn

4. Phiếu xét nghiệm

• Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Chuẩn bị mẫu

•  Đánh số trên mẫu bệnh phẩm và tuýp nhiệt, mỗi mẻ kèm theo một chứng âm.
•  Dùng pipét chuyên dụng c a hãng cung cấp hút 60 μl đờm ho c c n mẫu đờm đã xử lý bằng NALC-NaOH cho vào tuýp nhiệt.
•  Tiến hành tuýp nhiệt 900C (± 5 0C), trước khi lộn ngược tuýp vài lần.

2. Tách chiết ADN

•  Để tuýp nhiệt nguội 3 phút, lộn ngược tuýp 3 lần.
•  Lấy nắp tuýp hóa chất tách chiết ra khỏi thân để thẳng đứng vào giá và thay thế bằng tuýp nhiệt, lắc thật mạnh đến tan (I).
•  Chuẩn bị ống phản ứng LAMP (chuẩn bị đ số mẫu và 1 chứng âm, 1 chứng dương)
•  Lắp đầu lọc tách chiết ADN vào (I), bóp mạnh để thu ADN vào tuýp phản ứng LAMP (thể tíchADN nằm trong ngưỡng đánh dấu trên tuýp phản ứng).
•  Sau mỗi mẫu đóng nắp tuýp, l p lại với các ống tiếp theo.
•  Chuyển toàn bộ các mẫu đã chuẩn bị và chứng dương lên máy lắc chuyên dụng trong 2 phút và Spindown mẫu 10 giây.

3. Phản ứng LAMP

•  Chuyển mẫu vào máy PCR chuyên dụng LAMP, chạy phản ứng trong 40 phút tại 670C (thêm 5 phút cuối 800C).
•  Nhấc tuýp ra khỏi máy PCR và đ t tuýp vào khay đọc kết quả huỳnh quang.
•  Bật đèn và so sánh mức độ phát sáng c a mẫu với chứng âm và chứng dương.
•  Ghi chép lại kết quả xét nghiệm.
•  Vệ sinh khu vực làm việc bằng Hypochlorit sodium 0,5% và làm sạch lại bằng nước cất ho c cồn 70%.

IV. DIỄN GIẢI VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ

- Kiểm tra chất lượng bằng chứng âm và chứng dương.

•  Chứng âm: Không phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang.
•  Chứng dương: Phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang.

- Tất cả các mẻ xét nghiệm đ u thực hiện chứng âm và chứng dương.Chỉ trong trường hợp kết quả hai chứng như mô tả trên thì kết quả xét nghiệm các mẫu mới được chấp nhận.

- Khi quan sát dưới đèn huỳnh quang:

•  Phát quang: Mẫu dương tính: Có vi khuẩn lao.
•  Không phát quang: Mẫu âm tính: Không có vi khuẩn lao.

V. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

• Máy báo lỗi khi bệnh phẩm lẫn máu và thức ăn: sàng lọc kĩ bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.