Xét nghiệm định lượng mức độ phiên mã gen dung hợp BCR-ABL1 trong điều trị ung thư máu dòng tủy mạn tính

1.Xét nghiệm PCR kỹ thuật số

Thông thường, xét nghiệm này được thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR (RT-qPCR). Tuy nhiên, với kỹ thuật này các phòng xét nghiệm hiện tại đang sử dụng những bộ kit khác nhau, quy trình thao tác khác nhau nên sẽ cho ra độ nhạy cũng như độ đặc hiệu khác nhau.

Mặc dù có thể sử dụng thêm các mẫu hiệu chuẩn (calibrator) để chuẩn hóa kết quả định lượng nhưng sự biến thiên trong kết quả là không nhỏ, do bản chất cố hữu của kỹ thuật RT-qPCR.

Giới hạn phát hiện tối thiểu (LOD) của phương pháp RT-qPCR cũng không đủ để theo dõi bệnh nhân CML được điều trị và đáp ứng tốt với các thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs).

Theo Nghiên cứu ngẫu nhiên quốc tế về Interferon và STI571 (IRIS), trạng thái “đáp ứng phân tử chủ yếu” (Major Molecular Response, MMR) được định nghĩa là có sự giảm 3-log hay 1000 lần nồng độ mRNA BCR-ABL1 so với thời điểm bắt đầu điều trị.

Trong thang đo quốc tế (International Scale, IS), 3-log tương ứng với mức tỷ lệ đột biến 0,1%. Tiếp đến, tổ chức LeukemiaNet ở châu Âu đã định nghĩa trạng thái “đáp ứng phân tử hoàn toàn” là khi không phát hiện được mRNA BCR-ABL1 trong 2 lần xét nghiệm liên tiếp với phương pháp có độ nhạy 0,01% IS (MMR4).

Tuy nhiên, một số nghiên cứu theo dõi các bệnh nhân CML đạt được MMR4 cho thấy bên cạnh các bệnh nhân duy trì được trạng thái khỏi bệnh thì vẫn có một nhóm bệnh nhân bị tái phát. Điều này cho thấy độ nhạy hay giá trị LOD của phương pháp xét nghiệm là chưa đủ để phân biệt rạch ròi 2 nhóm bệnh nhân này.

Thêm vào đó, với sự xuất hiện của các thuốc TKI thế hệ 2, sẽ ngày càng có nhiều bệnh nhân đạt được mức MMR4. Lúc này, tiêu chí bệnh nhân đạt đến trạng thái “đáp ứng phân tử hoàn toàn” cần được xem xét lại cũng như cần một phương pháp xét nghiệm có LOD thấp hơn để chọn lọc ra đúng bệnh nhân phù hợp để dừng thuốc mà vẫn đảm bảo nguy cơ tái phát thấp.

Độ chính xác, đặc biệt là chỉ số LOD của kỹ thuật RT-qPCR cũng có thể ảnh hưởng đến các quyết định lâm sàng trong quá trình theo dõi các bệnh nhân CML được điều trị bằng TKI.

Sự gia tăng mức độ biểu hiện của mRNA BCR-ABL1 trong quá trình điều trị là một dấu hiệu cho thấy bệnh nhân cần được theo dõi và xét nghiệm thường xuyên hơn nhằm tìm ra các nguyên nhân gây kháng thuốc và loại bỏ vấn đề không tuân thủ lộ trình điều trị.

Một số nghiên cứu đề xuất mức tăng lượng mRNA BCR-ABL1 nên được chú ý trước khi có dấu hiệu lâm sàng rõ rệt là vào khoảng 0,3 đến 0,5 log (tăng 200% đến 316% lần so với lần xét nghiệm gần nhất). Tuy nhiên, mức tăng này đang dựa trên giới hạn độ chính xác của kỹ thuật RT-qPCR.

Trên thực tế, mức tăng lượng mRNA BCR-ABL1 có liên quan đến dấu hiệu lâm sàng có thể nhỏ hơn 0,3 log và cần có một kỹ thuật chính xác hơn để có thể phát hiện được.

Những thách thức đã nêu trên đòi hỏi các phòng xét nghiệm huyết học phải triển khai các kỹ thuật xét nghiệm mới với độ nhạy và độ chính xác cao hơn.

PCR kỹ thuật số hay PCR vi giọt kỹ thuật số (Droplet DigitalTM PCR, ddPCRTM) hiện đang là một công cụ phù hợp cho yêu cầu này. Đây là một công nghệ mạnh mẽ, cho phép định lượng tuyệt đối các axit nucleic với độ nhạy và độ chính xác cao.

Khi phân tích các mẫu chuẩn (calibrator) và mẫu lâm sàng pha loãng biết trước giá trí %IS dao động từ 0,001% đến 10%, PCR vi giọt kỹ thuật số cho kết quả với độ tuyến tính R2 > 0,999 (Hình 2). Đặc biệt, khi tăng hàm lượng RNA sử dụng lên 600 ng cho 1 giếng hoặc tăng số lượng giếng phân tích lên 6 giếng cho 1 mẫu thì giá trị LOD có thể đạt đến %IS ở mức 0,0001%.

Tính năng định lượng gen đích cho phép ddPCR phát hiện được từ 1 bản sao của gen đích. Trong khi đó, kỹ thuật RT-qPCR thường chỉ phát hiện được 10 bản sao gen mục tiêu trong một phản ứng và không thể tính toán kết quả từ nhiều phản ứng cho cùng 1 mẫu.

Khi xét về độ chính xác, kết quả định lượng bằng kỹ thuật ddPCR cho các mẫu lâm sàng pha loãng (%IS từ 10% đến 0,001%) có hệ số biến thiên CV% trong khoảng 8% đến 23%. Kết quả này được thực hiện bởi 2 kỹ thuật viên khác nhau ở 2 lần khác nhau cách 20 ngày.

Mỗi kỹ thuật viên lặp lại 3 giếng cho 1 mẫu RNA (Bảng 1). Từ kết quả này, có thể kết luận giá trị LOQ của xét nghiệm sử dụng kỹ thuật ddPCR là 0,001%. Trong khi đó, một nghiên cứu đa trung tâm sử dụng kỹ thuật RT-qPCR cho thấy có đến 42% các trung tâm cho kết quả kém chính xác với độ lệch hơn 5 lần (0,5 log) giữa các phản ứng lặp lại.

PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) là một công nghệ mới cho phép định lượng tuyệt đối các axit nucleic với độ nhạy và độ chính xác cao. Trong quy trình xét nghiệm định lượng mức độ phiên mã BCR-ABL1, kỹ thuật ddPCR thể hiện những điểm ưu việt hơn so với kỹ thuật RT-qPCR truyền thống:

1. Không cần sử dụng đường chuẩn cho gen mục tiêu và gen tham chiếu.
2. Tự động xác định tỷ lệ mRNA BCR-ABL1 theo thang quốc tế %IS hoặc giá trị “mức đáp ứng phân tử” (Molecular Response, MR) dựa trên số bản sao BCR-ABL1 và BCR hoặc ABL1.
3. Độ nhạy (LOD) theo thang quốc tế %IS đạt đến 0,0001%.
4. Ngưỡng định lượng trong khoảng tuyến tính (LOQ) theo thang quốc tế %IS đạt đến 0,001%.
5. Độ tuyến tính đạt R2 > 0,999 trong khoảng định lượng theo thang quốc tế %IS từ 0,001% đến 10%.
6. Cho phép tăng độ nhạy bằng cách sử dụng nhiều giếng phản ứng cho cùng một mẫu RNA xét nghiệm.