Phương pháp xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn Endotoxin

Theo quy định của các tiêu chuẩn quốc tế về trị liệu tế bào như ISCT, FACT, AABB, xét nghiệm xác định nội độc tố được xếp vào danh mục bắt buộc cần kiểm tra cho các sản phẩm tế bào trước khi sử dụng cho bệnh nhân.

1.Phép thử nội độc tố vi khuẩn

Phép thử nội độc tố vi khuẩn dùng để phát hiện hoặc định lượng nội độc tố của vi khuẩn có trong mẫu thử cần kiểm tra. Phương pháp sử dụng thuốc thử lysate là dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu loài sam biển, Limulus polyphemus hoặc Tachypleus tridentatus. Hiện nay có 3 phương pháp để thực hiện xét nghiệm:

• Phương pháp tạo gel dựa trên sự tạo thành gel. Khi bổ sung mẫu cần kiểm tra vào ống có chứa sẵn thuốc thử, sẽ tạo thành gel khi có mặt nội độc tố.
• Phương pháp đo độ đục, dựa vào sự thay đổi độ đục của thuốc thử lysat khi tạo gel.
• Phương pháp đo màu động học dựa trên sự thay đổi màu của phức hợp màu- peptid.

Tùy theo điều kiện của mỗi phòng xét nghiệm và tính chất của mẫu thử, sẽ áp dụng một trong các kỹ thuật thích hợp để thực hiện phép thử và phép thử sử dụng thiết bị và dụng cụ cho xét nghiệm phải free endotoxin. Khi có nghi ngờ hoặc tranh chấp, kết luận cuối cùng sẽ dựa vào phương pháp tạo gel trừ khi có chỉ dẫn khác.

2. Phương pháp tạo gel

Đây là phương pháp cho phép phát hiện hoặc xác định lượng nội độc tố trên sự tạo gel của thuốc thử lysate khi có mặt nội độc tố. Sử dụng một protein gây đông máu có trong loài sam biển. loại protein này được hoạt hóa khi có mặt nội độc tố. Phản ứng tạo gel bao gồm một loạt các bước kích hoạt enzyme trong Limulus Amebocyte Lysate. Xét nghiệm được thực hiện bởi thêm 0.1 mL mẫu thử vào trong ống xét nghiệm đã chuẩn bị sẵn 0.1 mL dung dịch thuốc thử LAL. Hỗn hợp này được trộn đều và ủ tại 37oC trong 60 phút. Đọc kết quả sau thời gian ủ này, phản ứng dương tính nếu gel tạo thành không bị chảy ra khi nhẹ nhàng dốc ngược ống nghiệm (180o), phản ứng âm tính khi không tạo thành gel hoặc gel không đủ chắc. Hạn chế của phương pháp gel-clot là thời gian xét nghiệm dài và thao tác chuẩn bị nhiều, sai sót do thao tác khá cao. Chỉ cho kết quả định tính. Không xác định được nồng độ chính xác trong mẫu thử.

3. Phương pháp đo độ đục

Còn gọi phép thử bán định lượng. Phương pháp đo độ đục tương tự như phương pháp sinh màu động học về phương pháp và cách tính toán lượng nội độc tố có trong mẫu xét nghiệm. Phép thử này xác định lượng nội độc tố có trong mẫu thử bằng cách thực hiện phản ứng tiến dần tới điểm dừng trong quá trình tạo gel. Là phương pháp trung gian giữa phương pháp tạo gel và so màu động học ngoại trừ bước cuối cùng. Các bước liên quan đến phân tách của một protein gây đông thông qua enzyme gây động được hoạt hóa. Sản phẩm phân tách liên hợp với nhau như kết quả của tương tác ion xảy ra sau khi phân tách, hỗn hợp phản ứng trở nên đục. Phương pháp đo độ đục xác định nồng độ nội độc tố theo 2 cách: động học và điểm cuối. cả 2 phương pháp đều yêu cầu xây dựng đường cong chuẩn. Nồng độ nội độc tố trong mẫu được xác định bằng cách đo mật độ quang so với đường cong chuẩn, khoảng thời gian cho đến khi đạt được mức độ đục của nồng độ thấp nhất của đường cong chuẩn.

4. Phương pháp đo màu

Còn gọi là so màu động học. Phương pháp được phát triển dựa trên 2 phương pháp tạo gel và đo độ đục trong năm 1977. Nội độc tố trong mẫu thử được xác định dựa trên chất màu được giải phóng ra từ một cơ chất mang màu là kết quả của phản ứng giữa nội độc tố với thuốc thử lysate. Có 2 kỹ thuật đo: đo màu tại điểm dừng và đo màu động học. Đo màu động học dựa trên mối tương quan giữa nồng độ và thời gian để hỗn hợp phản ứng đạt tới độ hấp thụ. Phương pháp này cũng cần xây dựng đường cong chuẩn, để xây dựng đường cong cần tối thiểu 3 nồng độ. Nồng độ nội độc tố trong mẫu thử được so màu với đường cong chuẩn. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay bởi tính tiện lợi và độ nhạy cao của phương pháp.

5. Một số điểm cần lưu ý trong xét nghiệm xác định nội độc tố

Phép thử nội độc tố không thích hợp với một số loại mẫu thử như nhũ dịch, hỗn dịch,...một số chất có thể cho phản ứng dương tính hoặc âm tính giả với thuốc thử lysate như các chế phẩm từ máu, polynucleotide, chế phẩm có chứa kim loại nặng, chất diện hoạt, nồng độ ion cao. Khi trong mẫu thử có chất ức chế hoặc tăng cường với hoạt động của LAL. Cách hữu hiệu nhất để vượt qua được là pha loãng mẫu, xử lý nhiệt, trung hòa pH....

Phương pháp xác định nội độc tố bằng hệ thống Endosafe của hãng Charles River được phê duyệt của FDA, Hoa Kỳ đang được sử dụng tại

Dựa trên phương pháp đo màu, Charles River, Mỹ đã cải tiến phương pháp so màu động học thành dạng thẻ, xét nghiệm nội độc tố chỉ trong vòng 30 phút, phù hợp với những liệu pháp tế bào mà mẫu cần được ghép cho bệnh nhân trong thời gian ngắn sau xử lý hoặc thu hoạch. Ưu điểm về thời gian có được nhờ đường cong chuẩn được xây dựng và tích hợp sẵn trong hệ thống máy endosafe.