Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc - bệnh viện 103

Bệnh viện 103

23:38 +07 Thứ hai, 14/06/2021

1. Định nghĩa và phân loại KSTRS kháng thuốc

1.1. Định nghĩa

Một chủng KSTSR được xem là kháng thuốc khi tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ thuốc tối thiểu đủ diệt hoặc ức chế sự nhân lên của KST.

Nói cách khác: khi uống và hấp thu đầy đủ một lượng thuốc bằng hoặc cao hơn lượng thông thường được khuyến cáo, nhưng dưới liều độc mà chủng KST vẫn có khả năng phát triển trong máu thì đó là chủng KST đã kháng thuốc.

1.2. Phân loại kháng thuốc

1.2.1. Phân loại theo mức độ kháng

Kháng một phần (tương đối): với nồng độ cao hơn nhưng chưa vượt liều độc thuốc vẫn có tác dụng.
Kháng hoàn toàn (tuyệt đối): với nồng độ tới liều độc vẫn không tác dụng

1.2.2. Phân loại theo nghiệm pháp in vivo 28 ngày

S (sensitivity: nhạy): với liều chuẩn, KST hết trong 7 ngày đầu, và không tái xuất hiện cho tới ngày 28.
R1(resistance: kháng) – kháng độ I: với liều chuẩn, KST hết trong 7 ngày đầu, nhưng tái xuất hiện trong 3 tuần lễ sau.
R2: kháng độ II – KST không hết trong tuần đầu (dưới 25% trong 3 ngày đầu).
R3: kháng độ III – KST không hết trong tuần đầu, trên 25% số lượng ban đầu trong 3 ngày đầu.

1.2.3. Phân biệt SKT kháng thuốc

Cần phân biệt KSTSR kháng thuốc với:

Uống thuốc không đủ liều, không đúng khoảng cách.
Thuốc hấp thu và chuyển hoá không tốt.
Trình độ miễn dịch với SR của bệnh nhân (SR sơ nhiễm và SR tái phát lâu năm, cơ thể khoẻ-yêú…).
Yếu tố di truyền (đáp ứng tự nhiên của cơ thể, loại acetyl hoá nhanh và chậm)
Độ nhạy cảm nguyên thuỷ của chủng loại KST với thuốc.

Cần phân biệt KST kháng thuốc với điều trị thất bại do thuốc (a và b). Ở vùng SR lưu hành, thường khó đánh giá hiện tượng KST kháng thuốc vì trên thể trạng SR lâu năm có khi không cần điêù trị cũng tự cắt cơn (c).

2. Tình hình KSTSR kháng thuốc trên thế giới và Việt Nam

Cho đến nay, 3 trong 5 loài KSTSR gây bệnh cho người đã được xác nhận kháng thuốc sốt rét là P.falciparum, P.vivax và P.malaria. Trong 3 loại KSTSR kháng thuốc trên, P.falciparum là loại KSTSR kháng thuốc có tần xuất cao nhất và đa kháng, P.vivax, P. malaria kháng chloroquin, kháng sulfadoxin- pyrimethamin với tần xuất thấp và không phổ biến. Do vậy, khi nói đến KSTSR kháng thuốc là nói đến P.falciparum.

2.1.Phân bố P. falciparum kháng thuốc trên thế giới

P. falciparum kháng thuốc phát triển rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên tần suất và qui mô hoàn toàn khác nhau giữa các vùng, tuỳ thuộc vào mức độ lưu hành SR, mật độ dân số, và lượng thuốc sử dụng…

Châu Mỹ: P. falciparrum kháng chloroquin được phát hiện đầu tiên 1960 ở biên giới Colombia-Venezuela, đến 1984 đã lan ra nhiều vùng ở Nam Mỹ; pyrimethamin bị kháng từ 1963, fansidar-từ 1981; mefloquin tới 1994 còn nhạy (WHO/1994); đã có hiện tượng kháng quinin ở Brasil.

Châu Á: P. falciparum kháng Chloroquin phát hiện những năm 1960-1962 ở Việt Nam, Thái Lan, Campuchia và Malaysia, được thông báo dần về sau là Philippin, Lào, Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc (1981), Pakistan 1984. ở Đông Nam Á, mức độ kháng chloroquin khác nhau tuỳ vùng và vùng kháng chloroquin gần trùng hợp với vùng có A. dyrus. Pyrimethamin bị kháng trước chloroquin vài năm, fansidar bị kháng cao ở Thái lan 1984, hiện tượng nhờn quinin tăng dần từ 1975, và từ sau 1982-1986 bắt đầu có kháng với mefloquin ở Thái lan (> 50%). Kháng artemisinin được ghi nhận ở Cambodia, Thailand, Myanmar từ năm 2001.

Châu Phi: Hiện tượng P. falciparum kháng Chloroquin được xác định ở Kenya và Tanzania 1978. Sau đó, hiện tượng này được phát hiện dần ở Đông Phi (Camerun 1985, Nigeria 1987…). Fansidar cũng bị kháng ở Đông Phi, lẻ tẻ ở Tây Phi. Một số thông báo về kháng Halofantrin (Basco và cs., 1991). Tới 1990 chưa thấy kháng rõ với Quinin. Có kháng Mefloquin in vitro, nhưng hãn hữu in vivo (WHO-1994).

Tới 1994, riêng vùng Trung Mỹ và Caribe chưa có thông báo P. falciparum kháng chloroquin. Ngược lại với P. falciparum, P. vivax mới xuất hiện kháng Chloroquin lẻ tẻ ở một số nơi (Papua New Guine 1989, Indonesia, Myanmar, Vanuatu). P. vivax cũng đã có kháng với Fansidar (1979), chưa thấy kháng Quinin và Mefloquin.

2.2.P.falciparum kháng artemisinin và ACTs khu vực Đông nam Á và trên thế giới

Theo dõi hiệu quả /hiệu lực của artemisinin nhằm phát hiện sớm thay đổi độ nhạy của P.falciparum ở các vùng quốc gia, quốc gia và các vùng lãnh thổ được WHO qui định mỗi 2 năm một lần.

Chỉ tiêu đánh giá dựa vào:

Tỉ lệ(%) số bệnh nhân còn phát hiện KST thể vô tính vào ngày thứ 3 điều trị.
Tỉ lệ (%) thất bại điều trị được đánh giá vào ngày 28 hoặc 42 (tùy thuốc phác đồ ACTs cụ thể).

Định nghĩa kháng artemisinin và ACT theo WHO (2014)

Nghi ngờ kháng: >10% số bệnh nhân xét nghiệm phát hiện thể vô tính trong máu vào ngày thứ 3 của điều trị
Kháng hoàn toàn: KSTSR phát hiện vào ngày thứ 3 và tái phát trong vòng 28 ngày/ 42 ngày hoặc tồn tại trong vòng 7 ngày sau khi điều trị artemisinin đơn thuần ( đảm bảo nồng tối thiểu độ đủ diệt KSTSR trong máu).

PH: phát hiện; CT: chính thức; ACT: artemisinin based combination therapy; AS: artesunat; L: lumefantrin; MQ: mefloquin; DHA: dihydroartemisinin; PPQ: piperaquin; D3: phát hiện P.falci vào ngày thứ 3; TF: treatment fallure

2.3. Tình hình KSTSR kháng thuốc ở Việt Nam

Chloroquin: P.falciparum kháng chloroquin được phát hiện từ 1960-1961

Ở miền Trung; độ kháng nặng và tăng nhanh
Ở Tây Nam: từ 85% (R1+ R2+ R3) năm 1978-1979 tăng lên 100% (R1+ R2+ R3) năm 1981-1982
Trên miền Bắc: P. falciparum kháng chloroquin không đồng đều.

Pyrimethamin được phát hiện bị kháng với P. falciparum từ 1970 ở miền Nam. Phối hợp pyrimethamin với quinin không hơn gì quinin đơn thuần. Fansidar xuất hiện kháng với chloroquin từ 1978 ở biên giới Tây Nam và tăng dần: tỷ lệ S (nhạy) từ 35% năm 1978 giảm dần xuống 18% năm 1980 và 7% năm 1981 (R1 = 45%, R2+3 = 48%).

Quinin từ 1971-1972 ở miền Nam cũng đã có hiện tượng bị kháng với P.falciparum: trong điều trị SR sơ nhiễm, R1 = 68% và 48%, R2+3 = 7% với tổng liều 8,4g và 13,2g (7 ngày và 11 ngày). ở biên giới Tây Nam độ kháng Quinin còn cao hơn.

Mefloquin mới sử dụng từ 1990 tới nay cũng đã cho tỷ lệ R1 là 11% và 14%.

Artemisinin và ACT: P.falciparum kháng dihydroartemisinin + piperaquin được phát hiện ở Bù Đăng, tỉnh Bình Phước vào năm 2009, Gia Lai: 2010, Đắc Nông và quảng Nam: 2012.

Tóm lại, tới nay ở Việt Nam P. falciparum đã đa kháng với nhiều thuốc SR, độ kháng thuốc nặng hơn ở miền Trung và miền nam so với miền Bắc, P. vivax chưa thấy xuất hiện kháng.

3. Cơ chế tác dụng của thuốc và cơ chế KST kháng thuốc

3.1. Các cơ chế tác dụng của thuốc điều trị sốt rét

Cạnh tranh với PABA (para amino benzoic acid), ức chế tổng hợp DHFA (dihydrofolic acid): sulfon, DDS…

Ức chế men chuyển hoá axit folic thành folinic: pyrimethamin…

Cạnh tranh với protein gắn Hem( ferriprotoporphyrine IX: FP-IX) hoặc tập trung vào lysosom của KST (do gradient pH): chloroquin, mefloquin…

Rối loạn chuyển hoá protein: quinin…

Rối loạn tổng hợp protein: artemisinin, tetracyclin…

Phong bế ty lạp thể: primaquin…

3.2. Cơ chế tác dụng và cơ chế KSTSR kháng thuốc của từng nhóm

3.2.1. Nhóm 4 amino-quinolein (chloroquin)và Amino alcool (mefloquin)

Cơ chế tác dụng: 2 giả thuyết:

– Giả thuyết Fitch: KST tiêu hoá hemoglobin và tạo ra ferriprotoporphyrin IX (FPIX – còn gọi hematin), thông thường chất FP gắn vào 1 protein của KST (còn gọi là protein gắn hem) để hình thành phức hợp “FP + protein gắn hem” – tức Hemozoin là một sắc tố SR không độc. Chloroquin cạnh tranh với protein gắn hem, để hình thành phức hợp “FP + Chloroquin” có tác dụng huỷ màng và diệt KST. FPIX được coi như 1 thụ thể có ái lực cao và đặc hiệu với Chloroquin (Fitch).

Riêng Mefloquin có thể gắn với 2 đích: FP và các phospholipid màng (FP + Mefloquin và phospholipid + Mefloquin), nên tác dụng huỷ màng và diệt KST cao hơn

– Giả thuết Gradient pH: Chloroquin tập trung trong lysosom của KST (độ toan cao) theo nguyên lý pH giữa 3 khoang có gradient: Ngoài hồng cầu – pH=7,4; trong hồng cầu (nguyên sinh chất) – pH=6,6; nguyên sinh chất của KST-pH=7,6 và lysosom của KST-pH=5,0. pH được duy trì bởi bơm proton H+. Ngoài ra, phospholipase của KST là tế bào đích của Chloroquin, khi men này bị ức chế, các phospholipid của màng sẽ biến đổi và sẽ có tăng thấm qua màng.

CQ: Chloroquin

Nhờ 1 permease (Warhurst)
Nhờ 1 yếu tố vận chuyển hoặc 1 thụ thể như FP (Krogstad).
Nhờ phospholipase của KST là đích của CQ.
Bơm proton H+.

Cơ chế kháng Chloroquin:

FP kết tụ nhanh hoặc có ái lực rất yếu với chloroquin, hoặc “protein gắn hem” của “KST kháng” tăng số lượng và ái lực với FP, cho nên phức hợp FP + chloroquin giảm (Fitch).
Bơm proton ngừng hoạt động: pH KST tăng.

Permease và phospholipid của “KST kháng” bị biến đổi ® thuốc Chloroquin dễ thoát (Warhurst – Ginsburg).

Gần đây phát hiện P. falciparrum đa kháng có gen MDR (multidrug resistant).
MDR tăng sự chuyển vận P. glycoprotein quá mức trên màng và làm tăng đào thải Chloroquin gấp 4 lần (D. A. Warrell).

3.2.2. Nhóm kháng folic và kháng folinic

Cơ chế tác dụng: KST phát triển nhờ vào quá trình tổng hợp axit folic của KST: KST phân bào cần có DNA; tiền chất DNA là những base purin và pyrimidin được tổng hợp nhờ THFA (tetrahydrofolic acid) là dạng hoạt hoá của DHFA (dihydrofolic acid).

Antifolic: Sulfon, Sulfamid có cấu trúc gần gũi với PABA (para-amino benzoic acid), cạnh tranh với PABA, dành nhau men tổng hợp axit dihydrofolic (dihydropteroate synthetase). ức chế men này, hậu quả là không tổng hợp DHFA.

Antifolinic: Pyrimethamin và Proguanil ức chế men khử acid dihydrofolic (dihydropteroate reductase), do đó không tạo đủ axit tetradihydrofolic (dihydropteroate reductase), do đó không tạo đủ axit tetrahydrofolic (THFA).

Thuốc SR hai nhóm này có ái lực với các men của SKT cao hơn so với những men của vật chủ.

Cơ chế kháng thuốc Sulfon, Sulfamid và Proguanil, pyrimethamin:

KST tăng sản xuất tăng sản xuất dihydropteroate synthease
Tạo dihydropteroate synthetase biến chất có ái lực yếu với sulfonamid
DHFA gắn với Pyrimethamin yếu hơn 400-800 lần so với chủng nhạy.
Lượng DHFA ở chủng kháng cao hơn chủng nhạy 30-80 lần.

Cơ chế KST kháng thuốc antifolic và antifolinic có thể do chromosom hoặc do Plasmid, 2 nhóm thuốc này bị kháng rất nhanh.

3.2.3.Nhóm Alcaloid quinquina (Quinin v.v..)

Cơ chế tác dụng:

Gây căng phồng những màng bao quanh KST và nhân.
Làm kết tụ những hạt hemosoin thành những đám nhờ phân chia trong cả bào tương (tương tự Mefloquin).
Cũng đều tạo phức hợp với FP-IX (như Mefloquin).

Cơ chế kháng:

Cho tới nay chưa thấy được sự thay đổi cấu trúc và thay đổi hoá sinh nên chưa cắt nghĩa được rõ cơ chế KST kháng với thuốc này; có thể cũng như ở Chloroquin, nhưng lại khó giải thích vì sao Quinin có tác dụng với một số chủng KST đã kháng Chloroquin ?

3.2.4. Nhóm Sesquiterpenes lactone (Artemisinin, Artésunat v.v..).

Cơ chế tác dụng :

Do cầu nối endo-peroxyd bị khử.
Thuốc chuyển hoá nhanh, giải phóng O2 tự do từ các cầu nối peroxyd, các gốc tự do mới sinh sẽ diệt KST.
Artemisinin ức chế tổng hợp protein rất sớm, gây vón kết nhân, màng KST, ty lạp thể, lysosom, màng nhân… của KST phù nề, tổn thương.

Cơ chế kháng: chưa xác định được.

3.2.5 Nhóm 8 amino quinolein (Primaquin…)

Cơ chế tác dụng:

Làm thay đổi hình thái “dạng ty lạp thể” (mitochondrie-like) ở thể tư dưỡng trong hồng cầu của P. berghei.
Cơ chế tác dụng có liên quan tới sự vận chuyển electron và với sự oxy hoá – khử của ubiquinon của KST.
Chưa thật rõ do Primaquin tác động trực tiếp hay qua trung gian của những chất chuyển hoá (như 6-OH-primaquin, 5-OH-primaquin, dihydroxyprimaquin…).

Cơ chế kháng:

Sự kháng của KST với primaquin (và dẫn xuất 8-aminoquinolein) khi dùng để diệt giao bào chưa được chứng minh.
Nhận thấy KST kháng thuốc và sống sót thường có số lớn ty lạp thể nhiều hơn KST bình thường, sự tăng sinh các ty lạp thể tạm coi là một trong những cơ chế KST kháng Primaquin.

3.3. Đặc điểm, nguyên nhân, hậu quả

3.3.1. Một số đặc điểm của KST kháng thuốc SR

Khi thuốc kháng 1 giai đoạn của KST, thường kháng các giai đoạn khác (như Pyrimethamin).

KST kháng Chloroquin có thể:

Duy trì suốt vòng đời
Truyền sang đời sau
Dễ có kháng chéo trong nhóm 4 aminoquinolein.
Có khả năng gây cho muỗi tăng nhiễm KST kháng.

KST kháng 4 aminoquinolein và Amino-alcool (Chloroquin và Mefloquin): Duy trì trong quá trình lan truyền mặc dù không có áp lực của thuốc.

Kháng Sulfonamid, Pyrimethamin và Chloroquin: tính kháng di truyền qua chu kỳ hữu tính ở muỗi sang đời sau.

3.3.2. Nguyên nhân của sự phát sinh phát triển KST kháng thuốc

3 nguyên nhân chủ yếu:

Áp lực thuốc (drugpressure):

– Dùng nhiều 1 loại thuốc, trong 1 thời gian dài, cho một đối tượng lớn trong quần thể – sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho chủng biến dị kháng tự nhiên dần dần nhân lên; thay thế những chủng nhạy bị tiêu diệt dần: còn gọi là quá trình sàng lọc của áp lực thuốc: Gen nhạy và kháng thuốc của P. falciparum là một phức hợp đã được chứng minh là nếu đạt đơn dòng thì có đáp ứng khác nhau với thuốc SR, có dòng nhạy, dòng kháng.

– Dùng nhiều 1 loại thuốc, trong 1 thời gian dài, nhất là khi dùng bừa bãi, không đủ liều, khi đối tượng bệnh nhân là SR sơ nhiễm có mật độ KST P. falciparum cao, khó diệt hết thì chủng KST dễ thích nghi dần với thuốc, đặc biệt loại thuốc kháng folic và kháng folinic, theo cơ chế kháng plasmid: còn gọi là quá trình thích nghi của KST dưới áp lực thuốc.

Sinh thái người – di biến động:

KST thường phát sinh phát triển kháng ở những nơi: có nhiều nguồn bệnh, mật độ KST cao, nhất là ở quần thể chưa có miễn dịch mới vào vùng SR nặng.
KST kháng thuốc lan rộng đi xa chủ yếu do nguồn bệnh di chuyển.

Sự tiếp nhận của muỗi địa phương:

KST kháng thuốc lan gần hay xa đều do di biến động bệnh nhân và khả năng tiếp nhận của muỗi địa phương.
KST kháng thuốc chỉ cắm rễ vào một địa phương khi chủng KST kháng hoàn thành được chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi địa phương.

3.3.3. Hậu quả của KST kháng thuốc

Điều trị triệt căn bệnh SR gặp khó khăn.

Bệnh SR vì thế diễn biến nặng hơn, dai dẳng, tái phát nhiều, tỷ lệ chuyển thành SRAT cao hơn, tử vong vì SR cũng tăng.

Dịch SR khó phòng chống, lại càng khó thanh toán, vì nguồn bệnh SR khó giải quyết, tỷ lệ muỗi nhiễm KST tăng lên, có nguy cơ lan rộng KSTSR kháng thuốc ra vùng khác.

Về mặt kinh tế: số ngày công lao động mất đi vì SR kháng thuốc sẽ tăng, số tiền chi cho điều trị bệnh nhân và cho nghiên cứu sản xuất thuốc chống kháng sẽ lớn.

3.3.4. Biện pháp phòng chống KST kháng thuốc

Ngăn ngừa KSTSR kháng thuốc:

Hướng dẫn và giám sát chặt chẽ công tác điều trị: đôn đốc việc điều trị nghiêm túc tại các cơ sở bệnh xá, bệnh viện cũng như tại tuyến y tế cơ sở.
Truyền thông rộng rãi cho cộng đồng biết tự chẩn đoán SR và tự điều trị chính xác. Quản lý cửa hàng thuốc tư.
Tăng cường kiểm tra KST ở mọi bệnh nhân điều trị, thực hiện điều trị triệt căn, đủ liều, đúng phác đồ. Hạn chế và thận trọng với chỉ định điều trị hàng loạt để ngăn ngừa yếu tố áp lực thuốc; không áp dụng biện pháp điều trị phỏng đoán với những liều thấp hơn liều thông thường quy định.
Với SR do P falciparum bắt buộc phải điều trị theo phác đồ ACTs và phải tuân thủ theo đúng chiến lược GPARC (global plan for artemisinin resistance containment) của WHO 2011 và hướng dẫn chẩn đoán và điều trị SR của BYT 2013.
Giám sát thường xuyên tình hình KST kháng thuốc trong vùng để kịp thời phát hiện sớm kháng thuốc.
Tăng cường công tác phòng chống vectơ truyền bệnh để hạn chế phát triển kháng thuốc.

Biện pháp xử trí KST kháng thuốc:

Nghiên cứu sản xuất thuốc SR chống kháng; thường xuyên giám sát hiệu lực của những thuốc đang dùng dù chưa bị hoặc đã bị kháng, để đánh giá sự phát triển và truyền của KST kháng.
Nghiên cứu tìm những phác đồ chống kháng tối ưu.
Tăng cường quản lý nguồn bệnh để hạn chế KST kháng thuốc lan truyền; tăng cường phòng chống vectơ để hạn chế lan truyền KST kháng.
Đẩy mạnh việc điều trị triệt căn hơn nữa; ngừng sử dụng những thuốc đã bị kháng cao.

3.4. Nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc và kháng thuốc

Ở mỗi địa phương từng thời kỳ cần đánh giá hiệu lực thuốc và tình hình KST kháng thuốc để chỉ đạo chiến lược, chiến thuật dùng thuốc; cần đánh giá hiệu lực cả những thuốc chưa kháng và đã kháng, vì hiện tượng kháng biến động. Có 2 loại test: test in vivo và test in vitro.

3.4.1. Test in vivo

Mục đích:

Đánh giá trực tiếp hiệu lực điều trị của 1 công thức thuốc.
Đo thời gian hết KST ở máu ngoại vi và thời gian hết sốt.
Trong 7 ngày đầu (tuần lễ I).
Tìm sự tái xuất hiện KST tới ngày 14 hoặc 28 (tuỳ test lựa chọn).

Điều kiện của test in vivo:

– Dùng liều thuốc đã được TCYTTG chuẩn định:

Chloroquin: 25 mg base/1kg cho 3 ngày (10 mg/1kg ngày 1 và ngày 2; 5mg/1kg ngày 3).
Quinin 10mg/1kg x 8 giờ 1 lần, trong 7 ngày.
Fansidar: 25mg/1kg Sulfadoxin và 1,25mg/kg Pyrimetamin, dùng 1 liều duy nhất.
Mefloquin: 12,5 mg/1kg dùng 1 liều duy nhất.
Artemisinin 20 mg/kg/24 giờ (ngày đầu), tiếp theo 10mg/kg/24 giờ (ngày thứ 2 đến thứ 6) và Artesunat 2mg/1kg/24 giờ (ngàu đầu), tiếp theo 1mg/kg/24 giờ (ngày 2-6). Liều dùng hai loại này chưa thật chuẩn vì chưa xác định được liều tối đa không độc của thuốc.

– Bệnh nhân:

Chưa có miễn dịch với SR (loại trừ yếu tố miễn dịch).
Mắc SR sơ nhiễm thể thông thường không nôn, không tiêu chảy, không có suy gan và suy thận (để loại trừ rối loạn hấp thu, chuyển hoá, thải trừ).

– Nồng độ KST trong 1mm3: không quá ít từ 1000 trở lên tới 30.000KST/mm3.

– Không có thuốc SR trong máu bệnh nhân (test Dill Glasko âm tính ở nước tiểu với Chloroquin…); tối thiểu không uống thuốc SR trong tuần trước.

– Loại trừ được tái nhiễm trong thời gian theo dõi bệnh nhân 14 hoặc 28 ngày (tuỳ test lựa chọn): phun hoá chất diệt muỗi tại nơi nghiên cứu, hoặc nghiên cứu ở vùng không có muỗi truyền bệnh.

Theo dõi test.

Thời gian 14 hoặc 28 ngày (tối ưu) (nên dùng test 28 ngày ở vùng lưu hành nhẹ và vừa; test 14 này dùng ở vùng lưu hành nặng).
Đo nhiệt độ hàng ngày (2-3 lần).
Lấy máu nhuộm soi KST những ngày: N0 (trước điều trị); N2 (48 giờ sau), N3 (72 giờ sau), N7, N14, N21, N28; – nhuộm giọt mỏng và giọt dày. Mỗi giọt dày có khoảng 20 bạch cầu; soi đủ 100 vi trường giọt dày (khoảng 0,25ml).
Đếm số lượng KST song song với số bạch cầu, tính mật độ KST tương ứng 8000 bạch cầu/mm3.

Đánh giá độ nhạy và kháng của KST: với test in vivo, cũng có thể đánh giá sơ bộ độ nhạy hoặc kháng của KST khi chọn đối tượng và xác định cỡ mẫu chính xác.

Lưu ý:

Nếu dùng phác đồ phối hợp thuốc, và nếu trước đó bệnh nhân đã dùng thuốc, test in vivo chỉ có giá trị đánh giá hiệu lực của điều trị, không đánh giá được độ kháng thuốc.
Với đối tượng là người mang KST lạnh, test in vivo không có giá trị nói lên hiệu lực của điều trị, mà có giá trị đánh giá KST kháng thuốc.
Test in vivo gặp những yếu tố giảm độ chính xác: khó đánh giá sức miễn dịch với SR của bệnh nhân ở vùng SR, khó loại trừ rối loạn hấp thu, chuyển hoá và thải trừ, khó phân biệt tái nhiễm hay tái phát khi KST xuất hiện lại.

3.4.2. Test in vitro

Vì những hạn chế của test in vivo trong việc đánh giá độ kháng thuốc của KST, cần thiết phải nuôi cấy KST và làm test in vitro để loại trừ các yếu tố của cơ thể bệnh nhân.

Mục đích: Test in vitro nhằm đo sự đáp ứng trực tiếp của KST khi tiếp xúc với thuốc (test in vivo đánh giá mức nhạy cảm của KST với thuốc trong cơ thể bệnh nhân; còn test in vitro đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc trong môi trường nuôi cấy).

Nguyên tắc của test in vitro: Thuốc diệt thể vô tính trong hồng cầu có tác dụng ức chế phân chia nhân của thể tư dưỡng (non) và ngăn ngừa phát triển thể phân liệt của KST khi tiếp xúc trực tiếp với những lượng thuốc tăng dần (sau 24-48 giờ ủ KST trong môi trường nuôi cấy có thuốc SR). Test in vitro còn có tên là SMIT (schizonte-maturation inhibition test).

Nội dung test in vitro:

Lấy máu bệnh nhân có KST; nuôi cấy vào môi trường; chia vào 8 giếng, trong đó 7 giếng có sẵn 1 lượng thuốc SR tăng dần theo luỹ thừa của 2, và 1 giếng làm chứng (chỉ có môi trường nuôi cấy KST, không có thuốc SR).
Nhuộm soi KST từ các giếng sau thời gian nuôi cấy, xác định giếng đầu tiên không tìm thấy thể phân liệt (tức là KST ngừng phát triển), nồng độ thuốc ở giếng đó là nồng độ đầu tiên ức chế KST của thử nghiệm.

In vitro macrotest WHO (1968):

Trên cơ sở kỹ thuật nuôi cấy 48 giờ trong môi trường glucose của Rieckmann đã phát triển Macrotest in vitro với lượng dung dịch là 1 ml máu + 5 mg glucose cho 1 nồng độ thuốc cho 1 giếng (cần 7 nồng độ thuốc và 2chứng, tức bằng 9ml máu cho 1 mẫu thử. Nồng độ Chloroquin cho 1 giếng: từ 0,25nanomol/ml đến 3 nanomol/ml; từ ³1,5nanomol/ml vẫn phát triển thể phân liệt là kháng Chloroquin.

Nvitro microtest: Từ 1978, macrotest được thay thế bằng nhiều microtest in vitro (Rieckmann 1978, Desjardins 1979, Le Bras 1980), tất cả đều sử dụng thành tựu nuôi liên tục P. falciparum của Trager và Jensen (1976): chỉ cần 1 lượng máu nhỏ (100ml) lấy từ đầu ngón tay + 900ml môi trường RPMI 1640 (50ml máu + môi trường cho 1 giếng, có 5% hồng cầu trong dung dịch nuôi cấy; cần 1 giếng chứng và 7 nồng độ thuốc).

Lượng thuốc SR dùng trong thử nghiệm:

Chloroquin từ 1 đến 64 pmol/giếng (7 giếng; tăng theo luỹ thừa của 2).
Quinin từ 4 đến 256 pmol/giếng
Mefloquin từ 2 đến 128 pmol/giếng
Halofantrin từ 0,015 đến 15,0 pmol/giếng
Artemisinin từ 0,15 đến 150,0 pmol/giếng (đậm độ thuốc Artemíinin trong hỗn hợp máu + môi trường sẽ là 3 đến 3000 nmol/l).

Tiêu chuẩn đánh giá thành công của mẫu thử:

Tại giếng chứng: Tỷ lệ phát triển thể phân liệt đạt ³ 10% so với 200 KST (bao gồm cả tư dưỡng và phân liệt), tức là phải có từ 20 thể phân liệt trở lên.

Ưu và nhược điểm của in vitro test:

– Test in vitro đo sự nhạy cảm của thuốc trực tiếp với KST và cho kết quả xác thực hơn test in vivo, nhưng đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật.

– Test in vitro có những hạn chế:

Giữ chủng KST ở nhiệt độ 2-8°C chỉ được 5-7 ngày; giữ chủng trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -96°C đảm bảo hơn, nhưng khi ngừng đông khô tỷ lệ KST còn sống thường không ổn định.
Thuốc SR còn trong máu bệnh nhân là 1 nguyên nhân không thành công của test in vitro.
Nếu dùng máu toàn phần, những bạch cầu và kháng thể có trong máu có thể góp phần diệt KST cùng với thuốc.
Mật độ KST trong máu tối thiểu phải 1000/mm3 trở lên thì thử nghiệm mới cho phép đọc kết quả chính xác

3.4.3. Phát hiện gen kháng thuốc của P.falciparum bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, sequencing…)

– Xác định gen kháng chloroquin: gene Pfmdr1,2 (P.falciparum multydrug) và gene Pftcr (P.falciparum tranporter chloroquin resistance). Gene Pfmdr-1 nằm ở NST số 5 có nhiệm vụ mã hóa cho P-glycoprotein homologne-1 (Pgh-1) có trách nhiệm gây ra kháng chloroquin vf các thuốc chống sốt rét khác. Các nhà khoa học còn tìm thấy có sự đột biến tại codon 86 (aspartic được thay thế bằng tyrocine)

– Xác định gen antifolate: tìm gen đặc hiệu kháng dihydrofolate reductase (DHFR) và dihydropteroate synthase (DHPS). Có 5 điểm đột biến: tại vi trí codon 436 serine được thay thế bởi alanine; tại codon 437 phenylalanine hoặc alanine được thay thế bởi glycine; tại codon 540 lysine được thay thế bởi glutamic; tại codon 581 alanine dược thay thế bởi glycine; tại codon 613 alanine được thay thế bởi serine hoặc threonin.

– Kháng pyrimethamin: tìm đột biến đặc hiệu trên gen DHFR: tại codon16 alanine được thay thế bởi valine; codon 51asparagine thây thế bới isoleusine;codon 59 cystein thay thế bởi arginine; codon 108 serine thay thế bởi asparagine, codon 164 isoleusine thay thế bởi leusine.

– Kháng quinine: tìm gen Pfmdr-1 kết hợp với Pftcr

– Xác định gen kháng mefloquin: tìm gen Pfmdr1 tại các vị trí Ser1034, Asn1042 và Asp1246

– Xác định đột biến kháng artemisinin tại vùng Keich 13 (K13).

Nguồn: Bệnh viện 103