Parvo virus B19 Real-time PCR - Bộ y tế 2018

Bác Sĩ Thúy

12:27 +07 Thứ tư, 17/08/2022

Chia sẻ

Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh - Bộ y tế 2018

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện và định lượng Parvo virus B19 trong huyết tương ho c huyết thanh và dịch ối c a người.

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Máy tách chiết acid nucleic.
Bộ lưu điện.
Máy nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút
T lạnh 20C -8 0C
T âm sâu (-200 C) ho c (-700C) (nếu có)
Máy vortex
T an toàn sinh học
Micropipettes các thể tích từ 0,5 l - 1000 l.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương, và dịch ối.

4. Phiếu xét nghiệm

Đi n đầy đ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

LightMix® Kit Parvovirus B19 EC (Roche – VD ho c tương đương)

2.1. Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.

2.2. Tách chiết DNA:

Tách chiết bằng tay ho c máy tự động

2.3. Chạy bù màu và thẩm định file bù màu:

Theo hướng dẫn kit LightMix®Color Compensation HybProbe. Bù màu khuyến cáo chạy khi thay lô c a kít ho c 6 tháng chạy bù màu 1 lần.

2.4. Thực hiện phản ứng real-time PCR

* Bật máy LC480, bật máy tính và phần m m LC480.

- Pha hóa chất:

Pha hỗn hợp primer và probe cho B19 (PSR) và Chứng nội ECT (reaction control)
Chuẩn bị ECT
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị NTC (chứng âm)
Chuẩn bị dãy ống mẫu chuẩn
Chuẩn bị trộn hỗn hợp phản ứng PCR
Chạy real-time PCR

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

- Giá trị định lượng chấp nhận được nếu cả 3 chứng: chứng âm, chứng dương và chứng nội có nghĩa. Các chứng có giá như sau:

Chứng âm: không phát hiện.
Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép c a nhà sản xuất (đ c hiệu với từng lô thuốc thử).
Chứng nội: với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000 copies) phải có tín hiệu lên ứng với Ct khoảng 27 đến 30.

- Ngược lại:

Chứng âm: Nếu chứng âm không hợp lệ thì phải thực hiện lại xét nghiệm cả chứng và toàn bộ lô bệnh phẩm.
Chứng dương: Nếu chứng dương không hợp lệ thì phải làm lại xét nghiệm toàn bộ mẻ chạy.
Chứng nội: không có tín hiệu lên với chứng âm và mẫu cónồng độ thấp (10-1000copies) ứng với Ct khoảng 27 đến 30 thì phải chạy lại mẫu đó.

2. Phân tích mẫu

2.1.Bảng biện luận kết quả:

2.2 Hệ số chuyển đổi

- Định lượng virus (VL) được tính toán sử dụng công thức sau:

VL(copies/ml) = MV(giá trị đo được) x EVF x SF

+ Trong đó:

VL = giá trị định lượng
MV = giá trị đo được [số copy trên phản ứng]
EVF = hệ số thể tích tách chiết [thể tích tách chiết thu được/ thể tích PCR]
SF = hệ số mẫu [1000 μl/thể tích tách chiết c a mẫu bệnh phẩm]

- Ví dụ:

+ Lấy 200 μl mẫu bệnh phẩm đi tách chiết thì hệ số mẫu SF = 1000/200=5.

+ Dùng 5 μl trong tổng thể tích thu hồi là 100 μl làm template mix PCR thì hệ số thể tích tách chiết = 100/5=20.

+ Kết quả hệ số chuyển đổi là:

VL (copies/ml) = MV (giá trị đo được copies/phản ứng 20 μl) x 5 x 20
VL (copies/ml) = MV(copies/phản ứng) x 100

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn g p sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.